Roberto PANTANI | Projects

STUDIO DELLA CRESCITA CELLULARE IN COLTURE CONTINUE E SEMICONTINUE DEL LIEVITO S. CEREVISIAE: MECCANISMI DI REGOLAZIONE DELLA CRESCITA (TOR E INIBIZIONE), IDENTIFICAZIONE DI MOLECOLE CON VALENZA FARMACOLOGICA CAPACI DI INTERAGIRE CON TALI MECCANI

Il progetto di ricerca si svilupperà utilizzando ceppi di lievito appartenenti tutti alla famiglia CEN.PK di S. cerevisiae, un lievito convenzionale, sensibile al glucosio, storicamente impiegato per produrre masse microbiche (vedi il lievito per la panificazione) e, attualmente, proteine eterologhe da ceppi ricombinanti, essendo S. cerevisiae uno dei pochi eucarioti approvati dalla FDA (Food and Drug Administration) e dall' EMEA (European Agency for the Evaluation of Medicinal Products). I lieviti verranno coltivati in sistemi batch, continui e semicontinui. In particolare, per quanto riguarda questi ultimi, si studierà la cinetica di crescita e quella di morte del lievito. I brodi esausti verranno saggiati per evidenziare la presenza di attività inibitrice della crescita. Si procederà alla determinazione delle concentrazioni del glucosio residuo e dell'etanolo eventualmente prodotto. Un'analisi delle altre componenti chimiche presenti nei brodi e capaci di influenzare la crescitamicrobica verrà effettuata tramite NMR. La velocità di crescita della popolazione microbica sarà controllata attraverso il profilo di alimentazione e fatta variare in un range di valori tali da non superare la soglia critica, che determina lo shift tra metabolismo ossidativo e quello fermentativo. La cinetica di crescita e quella di morte del lievito osservata nei sistemi semi-continuì verrà raffrontata a quella ottenuta nelle stesse condizioni; ma in presenza di macrolidi rapamicina-simili capaci di rallentare o bloccare la proliferazione cellulare. Tutte le prove verranno effettuate in un fermentatore, il Bio-Flo 110- New Brunswick Scientific funzionante in modalità semicontinua e corredato di un mass flow controller per l'arricchimento dell'aria con ossigeno puro e di un analizzatore dei gas esausti (EX-2000). Si pensa di alimentare il fermentatore con una portata volumetrica variabile in modo tale da promuovere un metabolismo pienamente respiratorio del lievito. Le prove infed-batch saranno condotte in un fermentatore Biostat-Q plus provvisto di Unità per il controllo individuale di tre vessels e, quindi, la possibilità di effettuare tre prove di fermentazione in parallelo. Il Biostat-Q plus è una acquisizione recente del laboratorio T5b, resa possibile con i fondi del PON 2011. I dati ottenuti dagli esperimenti condotti in diverse condizioni, saranno utilizzati per le simulazioni e per formulare un'ipotesi innovativa sulle dinamiche fisiologiche che si generano durante la crescita cellulare. In questa fase, il lavoro si evolverà sulla base di un confronto tra i gruppi di ricerca coinvolti (quello di Microbiologia Industriale dell'Università di Salerno che fa capo alla scrivente, quello di Microbiologia Industriale dell'Università di Napoli "Federico II" che fa capo alla Prof. E. de Alteriis e quello di modellizzazione dell'Università di Napoli "Federico II" guidato dal Prof. S. Mazzoleni) per lo sviluppo di un modello matematico ulteriormente aggiornato rispetto a quello recentemente pubblicato nel quale si tenga conto dei delicati equilibri che si vengono a creare tra fase catabolica e anabolica della crescita cellulare stessa.