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ANALISI DELL'ATTIVITA' ANTI-LINFATICA DI VEGFR3

OBIETTIVO 1. Determinare gli effetti patologici di manipolazione dell'espressione di VEGFR3 nel topoI dati del nostro gruppo e da altri indicano che tessuti diversi rispondono in modo diverso a VEGFR3. Proponiamo quindi di verificare nel topo l'esito fenotipico della sovra-espressione e della sotto-espressione di VEGFR3. Ci aspettiamo che questo approccio bidirezionale aumenterà la solidità dei risultati ottenuti e aiutare nella loro interpretazione. Metodi sperimentali Genereremo dei topi in cui l’espressione di VEGFR3 sarà incrementato o ridotto specificamente nelle CE. Per inattivare VEGFR3 nelle CE, incroceremo topi Vegfr3flox/flox con topi Tie2Cre o VE-CadherinERT-Cre. Quest'ultime sono due linee murine indipendenti che esprimono la Cre ricombinasi in modo CE-specifica. Per sovraesprimere VEGFR3 in CE, incroceremo topi Vegfr3Tg con topi Tie2Cre o topi VE-CadherinERT-Cre. Il topo Vegfr3Tg, che e' stato generato recentemente da noi, esprime un transgene Vegfr3 Cre-inducibile. Analizzeremo lo sviluppo dei vasi linfatici su sezioni istologiche di embrioni tra gli stadi embrionali E11.5 e E15.5, e se i mutanti sono vitali, nei tessuti adulti. Tutti i topi sopraindicati e un buon numero di marcatori molecolari vaso linfatico-specifici e anticorpi vaso sanguigno-specifici sono disponibili nel laboratorio del richiedente. OBIETTIVO 2. Sviluppare un saggio funzionale basato su cellule endoteliali linfatiche che è adatto a studi sui meccanismi patogenetici e per lo screening di farmaci. Al fine di ottenere informazioni sui meccanismi patogenetici è conveniente disporre di saggi funzionali a base di cellule. Tali saggi riducono la complessità molecolare dell'ambiente e dunque facilitano l'interpretazione di dati sperimentali che sarebbe difficile da ottenere in vivo. Sono anche adatte allo screening iniziale di composti, dopodiche un numero ridotto di composti promettenti possono essere valutati in vivo. Il modello che proponiamo qui si basa sul saggio MatrigelTM, un sistema di coltura cellulare 3-dimensionale che permette la formazione di microtubuli endoteliali. Il saggio Matrigel è un modello ampiamente accettato per studiare l’organizzazione delle cellule endoteliali e la formazione di vasi. Metodi sperimentali Utilizzeremo il saggio Matrigel come modello della linfangiogenesi per verificare se la carenza o la sovra-espressione di VEGFR3 nelle CE linfatiche influisce sulla formazione o la ramificazione dei microtubuli. Per abbattere l’espressione di VEGFR3 utilizzeremo la tecnica di RNA interference. Per sovra-esprimere VEGFR3, trasfetteremo le CE linfatiche con lo stesso costrutto transgenico che è stato utilizzato per generare il topo Vegfr3Tg. Ci aspettiamo che l’alterazione dell'espressione di VEGFR3 porterà ad un fenotipo cellulare facilmente identificabile, come ad esempio un aumento o una diminuzione del numero di punti di ramificazione microtubulare o un alterato diametro o morfologia dei microtubuli. Tali fenotipi saranno sfruttati per l’analisi in vitro di bersagli candidati di VEGFR3. Siamo particolarmente interessati nel valutare la via di segnalazione Delta / Notch, perché alcuni dati recenti suggeriscono che sono i livelli locali di Delta / Notch che determinano se VEGFR3 promuove o inibisce la proliferazione endoteliale (Benedito, 2012).Referenze citate nelle sezioni 11 e 12Paavonen et al. Am. J. Pathol. 156:1499-1504 (2000) Valtola et al. Am. J. Pathol. 155: 1381-1390 (1999) Tammela et al. Nature, 454:656-660 (2008)Tammela et al. Nature Cell Biol, 13:1202-1213 (2011)Benedito et al. Nature, 484:7392 (2012)