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STIMA DELLA BIODIVERSITÀ GENETICA MEDIANTE MARCATORI MOLECOLARI RAPD DI POPOLAZIONI DI DITTRICHIA VISCOSA (L.) GREUTER DELL¿ITALIA CENTRO-MERIDIONALE E SUA COLTIVAZIONE IN VITRO.

Il progetto sarà articolato in più fasi volte a: 1. campionamento e conservazione di semi raccolti da piante di D. viscosa di popolazioni naturali in ambienti antropizzati e non; 2. messa a punto di un adeguato protocollo di sterilizzazione chimica dei semi di D. viscosa e delle condizioni ottimali di germinabilità; 3. messa a punto del protocollo di propagazione in vitro mediante semenzali; 4. coltivazione in vitro delle plantule germinate su terreno sintetico e loro micropropagazione mediante microtalee nodali; 5. studio della variabilità genetica delle popolazioni di D. viscosa in esame mediante l’uso di marcatori molecolari. La prima fase sperimentale prevede l’identificazione di popolazioni di D. viscosa cresciute in ambienti antropizzati e non, allo scopo di identificare eventuali differenze intra e interpopolazione. I semi saranno conservati a temperatura ambiente, dopo un breve periodo di vernalizzazione (4°C). Si procederà in seguito alla messa a punto di un idoneoprotocollo per la sterilizzazione chimica dei semi, mediante l’impiego di differenti reagenti (e.g., etanolo, ipoclorito di sodio, etc.) e modulando i tempi di esposizione dei semi agli stessi. Il protocollo dovrà garantire la perfetta sterilizzazione dei semi senza alterarne la germinabilità. In seguito sarà valutata la germinabilità dei semi sterilizzati in vitro su diversi terrreni di coltura (e.g, M&S, Gamborg, etc.). Ottenute le giovani plantule, si provvederà alla messa a punto del protocollo per la loro propagazione vegetativa mediante microtalee nodali su diversi terreni di coltura sintetici. Tutte le plantule ottenute dai semenzali saranno trapiantate su terreno torboso per giardinaggio, acclimatate e trasferite in serra con parametri controllati di temperatura, luce e umidità. Un’ulteriore fase sperimentale prevede la caratterizzazione molecolare delle piante ottenute dai semenzali mediante l’uso di marcatori molecolari RAPD. Obiettivo dell’analisi è quello distudiare la biodiversità genetica, determinare la diversità genetica intra- e inter-popolazione, valutare la distribuzione della variabilità genetica per definire le strategie più opportune di approvvigionamento di seme per studi di genetica di popolazione e/o di fitorisanamento. In particolare, sarà valutato se piante ottenute dai semi di D. viscosa di differenti popolazioni, che crescono in differenti località diversificate dal punto di vista pedoclimatico, presentino strette relazioni genetiche tra loro o se, al contrario, eventuali differenze riscontrate siano in qualche modo correlabili alle caratteristiche ecologiche dei siti, nonché alla loro distanza geografica. Per l’analisi RAPD, dalle foglie di ciascuna pianta propagata sarà estratto il DNA genomico, mediante metodiche convenzionali, e sarà valutata la qualità e la quantità degli acidi nucleici estratti, mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio e analisi spettrofotometrica. La caratterizzazione molecolare sarà realizzata mediante un pannello di primers oligonucleotidi RAPD. I dati molecolari saranno analizzati ed elaborati mediante software dedicati allo studio della biodiversità genetica (GenAlEx, PowerMarker, etc.). In particolare, per caratterizzare il livello di polimorfismo genetico esistente tra le piante di D. viscosa, sui dati molecolari saranno calcolati gli indici più comunemente utilizzati per questo tipo di indagine molecolare: eterozigosità osservata (Ho); eterozigosità attesa (He); Polymorphism Index Content (PIC); coefficiente di inbreeding (f). Sarà inoltre condotta un’analisi statistica mediante software Structure allo scopo di stimare il grado di variabilità genetica nel set di campioni indagati.