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RUOLO DELLA CODA GLICOSILFOSFATIDILINOSITOLO DEL RECETTORE DELL'UROCHINASI NELLA MIGRAZIONE CELLULARE

Lo studio sarà effettuato su cellule di carcinoma di prostata (PC3), dotate di elevato potenziale invasivo e caratterizzate da un’elevata espressione di uPAR. Al fine di esaminare l’importanza dell’ancora GPI dell’uPAR nella migrazione di tali cellule, saranno innanzitutto messe a punto le condizioni ottimali per degradare la coda GPI del recettore con fosfolipasi D fosfatidilinositolo specifica (PI-PLC), verificando tale degradazione, e quindi il rilascio della forma solubile del recettore, mediante analisi per western blot con anticorpi anti-uPAR dei lisati e dei supernatanti delle cellule trattate. Successivamente verranno effettuati saggi di migrazione verso siero in camera di Boyden, utilizzando cellule trattate o meno con la PI-PLC nelle concentrazioni e con i tempi scelti.Poiché le proteine GPI sono spesso associate a Lipid Rafts, indagheremo se anche l’uPAR, nel sistema cellulare scelto, si associ ai Lipid Rafts, isolando tali strutture mediante gradiente discontinuo di saccarosio e ultracentrifugazione, e analizzando le varie frazioni del gradiente mediante western blot con anticorpi specifici diretti contro il recettore. Valuteremo tale ripartizione in cellule stimolate o meno con siero (condizione analoga a quella usata nei saggi di migrazione cellulare). Sarà valutata anche, eventualmente, la ripartizione dei suoi partners di segnale.Una volta esaminata la ripartizione dell’uPAR e dei suoi interattori nei Lipid Rafts in cellule PC3, tratteremo tali cellule con methyl-ciclodestrina (MCD) che, sequestrando il colesterolo, disgrega i Lipid Rafts. Anche in questo caso sarà necessario mettere a punto le condizioni ideali per ottenere il massimo effetto con la minima dose, in quanto tale sostanza è tossica per le cellule. Verificheremo quindi nuovamente la ripartizione dell’uPAR sulla superficie cellulare e, successivamente, valuteremo quanto influisce la disgregazione dei Lipid Rafts sulla capacità dell’uPAR di controllare i meccanismi di migrazione cellulare, mediante saggi di migrazione in camera di Boyden con cellule trattate o meno con MCD. Tali esperimenti contribuiranno a chiarire il ruolo e l’importanza della coda GPI dell’uPAR nei meccanismi che permettono al recettore stesso di controllare la migrazione cellulare.Poiché l’uPAR ha un indubbio ruolo nelle varie fasi della cancerogenesi e della progressione tumorale, la comprensione dei meccanismi molecolari attraverso i quali si attua tale funzione può contribuire alla progettazione di nuove strategie antitumorali.