Paolo REMONDELLI | Progetti

RUOLO DELLA SYNAPTOGIANINA1 NELLA PATOGENESI DEL PARKINSON

Sebbene alcuni studi in modelli cellulari e animali abbiano definito un ruolo specifico di SYNJ1 nella regolazione della funzione delle vescicole sinaptiche, attualmente non è ancora stato definito il ruolo di questa proteina nella biogenesi dei compartimenti cellulari nel corso del differenziamento della cellula nervosa. Inoltre, poco o nulla è conosciuto in relazione ai meccanismi cellulari alla base dei difetti clinici ed anatomopatologici rilevati nei pazienti affetti da PD/SYNJ1. Allo scopo di ottenere un modello cellulare per lo studio delle alterazioni morfofunzionali causate dalla espressione della forma mutata del gene SYNJ1 verranno prodotti vettori di espressione retrovirale in grado di esprimere costitutivamente la forma normale (SYNJ1p) e quella mutata (SYNJ1Arg258Gln) della proteina. Come modello di cellula neuronale verranno utilizzate cellule di teratocarcinoma umano NT2 indotte al differenziamento mediante acido retinoico (NT2-N) o, in alternativa, cellule PC12 indotte da NGF.In tali cellule verranno valutati sia i livelli di espressione (mediante analisi per QRT-PCR e western blot), che la localizzazione intracellulare della proteina SYNJ1 endogena. Mediante microscopia confocale verranno valutati i livelli di colocalizzazione della proteina endogena con marcatori specifici dei differenti compartimenti cellulari ed in particolare con auxillina ed endofilina, interattori noti di SYNJ1 nell’ambito della via endocitica. Le analisi della espressione di SYNJ1 verranno effettuate a vari tempi di induzione del differenziamento neuronale fino al raggiungimento del definitivo stato differenziato valutato attraverso i livelli di espressione di marcatori specifici e analisi delle caratteristiche morfologiche dello stato differenziato. mRNA esprimente SYNJ1 verrà retrotrascritto e clonato in vettori di espressione retrovirali. Attraverso mutagenesi sito specifica basata su PCR verrà introdotta la mutazione 773G>A, il cui inserimento verrà verificato mediante sequenziamento del DNA. Verranno inoltre prodotti vettori di espressione in grado di esprimere proteine ricombinanti della forma normale SYNJ1p o la forma mutata SYNJ1(Arg258Gln) fuse alla GFP da utilizzare in trasfezioni transienti per valutare la localizzazione intracellulare e le proprietà di interazione del mutante SYNJ1(Arg258Gln) nel corso del differenziamento neuronale.Mediante procedure standardizzate saranno selezionati cloni cellulari di NT2 o PC12 in grado di esprimere elevati livelli della proteina normale SYNJ1p o della sua forma mutata SYNJ1(Arg258Gln). I cloni esprimenti SYNJ1 normale o mutata verranno sottoposti ad analisi morfologiche mediante microscopia elettronica allo scopo di valutare complessivamente gli effetti della espressione del gene mutato sulla organizzazione morfofunzionale dei differenti compartimenti cellulari, del citoscheletro e la presenza di aggregati cellulari in grado di generare inclusioni cellulari tipiche del fenotipo cellulare del PD. Verrà inoltre valutata la presenza di strutture tipiche di processi autofagici. Le eventuali alterazioni morfologiche verranno esaminate a vari tempi della induzione del differenziamento neuronale.Simili esperimenti saranno condotti mediante microscopia confocale. In particolare verrà esaminata la corretta biogenesi ed organizzazione morfologica del Reticolo Endoplasmatico e dei fasci di microtubuli con particolare attenzione alla corretta formazione di siti di contatto con la membrana plasmatica. Tale evento dipende dal metabolismo del PI(4,5)P2 e garantisce la corretta omeostasi del Ca essenziale per la fisiologia della trasmissione sinaptica. Infine, in cellule esprimenti la forma mutata SYNJ1(Arg258Gln) saranno valutati i livelli di espressione di proteine proapoptotiche (Bid, Bad, Bim, Noxa) e del marcatori diagnostici tau e tau fosforilata utilizzati come criterio di supporto alla diagnosi differenziale delle demenze.