Paolo REMONDELLI | Progetti

TRAFFICO VESCICOLARE IN UN MODELLO CELLULARE DI PATOLOGIA NEURODEGENERATIVA

Saranno prodotti vettori di espressione in grado di esprimere la forma normale o mutata recanti la mutazione Arg288Gln dell’esone 5 del gene Synj-1 fusa al gene reporter GFP. La mutazione Arg288Gln è stata evidenziata in pazienti affetti da Parkinson (PD). La mutazione missenso è localizzata nel dominio Sac-1 della proteina Synj-1 e compromette l’attività fosfatasica determinando alterazioni nel normale processo endocitico e del riciclo delle vescicole sinaptiche. Verrà effettuata una mutagenesi sito-specifica su vettori di espressione commercialmente disponibili utilizzando oligonucleotidi sintetici complementari contenenti la mutazione desiderata e una polimerasi termostabile, la DNA polimerasi FastStart™ High Fidelity (Roche), che replica entrambi i filamenti plasmidici partendo dai primers mutati. Per la mutagenesi sarà utilizzato come stampo DNA metilato suscettibile alla successiva digestione con Dpn I. Il DNA sarà utilizzato per trasformare cellule batteriche competenti e dai cloni selezionati è stata eseguita una minipreparazione del DNA plasmidico. L’inserimento della corretta mutazione sarà confermato mediante sequenziamento del cDNA . Mediante procedure standardizzate saranno selezionati cloni cellulari di HeLa, NT2 o PC12 in grado di esprimere elevati livelli della proteina normale SYNJ1p o della sua forma mutata SYNJ1(Arg258Gln). I cloni esprimenti SYNJ1 normale o mutata verranno sottoposti ad analisi morfologiche mediante microscopia elettronica allo scopo di valutare complessivamente gli effetti della espressione del gene mutato sulla organizzazione morfofunzionale dei differenti compartimenti cellulari, del citoscheletro e la presenza di aggregati cellulari in grado di generare inclusioni cellulari tipiche del fenotipo cellulare del PD. Per valutare il ruolo di Synj-1 sull'organizzazione del pathway secretorio fra Reticolo Endoplasmatico (RE) e Golgi, verrà esaminata per microscopia confocale la localizzazione di marcatori specifici dei compartimenti intracellulari coinvolti nel traffico vescicolare fra RE e Golgi quali ERGIC-53, GM-130 e Giantina nelle linee esprimenti ed in cellule normali. ERGIC-53 (Endoplasmic Reticulum Golgi Intermediate Compartment 53 protein) è una lectina transmembrana usata come marcatore del compartimento intermedio tra RE e Golgi (ERGIC). GM-130 è una proteina del cis-Golgi che agisce come recettore di ancoraggio delle vescicole durante la fusione vescicolare. Infine, Giantina una proteina che nel citoplasma è coinvolta nell'attacco alle vescicole COPI al Golgi mediale. I risultati hanno dimostrato alterazioni della distribuzione intracellulare di ERGIC-53 e GM130 e una ridotta dimensione dell'Apparato di Golgi indicando un difetto di traffico vescicolare fra RE e Golgi. La ridotta espressione di Synj-1 altera il traffico vescicolare fra RE e Golgi indicando alterazioni a livello della gemmazione vescicolare del RE. Sarà pertanto analizzato l'effetto della della espressionedella proteina SYNJ1p normale o della sua forma mutata SYNJ1(Arg258Gln) sul assemblaggio del rivestimento vescicolare COP-II. A tale scopo sarà analizzata nei mutanti la localizzazione delle proteine Sec-16 e Sec-31, rispettivamente marcatori dei siti di uscita dal RE e del rivestimento esterno delle vescicole COP-II responsabili del traffico anterogrado fra RE e Golgi. Verrà inoltre valutata la presenza di strutture tipiche di processi autofagici. Le eventuali alterazioni morfologiche verranno esaminate a vari tempi della induzione del differenziamento neuronale. Simili esperimenti saranno condotti mediante microscopia confocale. In particolare verrà esaminata la corretta biogenesi ed organizzazione morfologica del Reticolo Endoplasmatico e dei fasci di microtubuli con particolare attenzione alla corretta formazione di siti di contatto con la membrana plasmatica.