Massimo TRIGGIANI | Projects

BIOMARKERS POSTTRASCRIZIONALI DI INFIAMMAZIONE CRONICA RESPIRATORIA E DI RISPOSTA ALLA TERAPIA CON GLUCOCORTICOIDI

Ipotizziamo che nelle cellule epiteliali respiratorie e nei leucociti del sangue periferico (perypheral blood mononuclear cells, PBMC) di pazienti con patologie respiratorie croniche infiammatorie vi siano alterazioni dei livelli e/o di attivazione delle tre RBPs in studio e che il trattamento con GC modifichi l'espressione/funzione di TTP e/o AUF-1, ossia delle RBPs che mediano una accelerazione della degradazione di trascritti infiammatori. Ipotizziamo che tali cambiamenti: a) correlino con l’espressione di geni validati come soggetti alla regolazione (targets) delle RBPs; b) correlino con indici biologici e clinici di infiammazione e/o di risposta alla terapia. E' importante sottolineare che non esistono al momento in letteratura dati traslazionali che verifichino l'impatto della regolazione RBP-mediata nella fisiopatologia delle malattie croniche infiammatorie respiratorie, o nella risposta alla terapia.Dopo l’approvazione del protocollo da parte del Comitato Etico competente e la raccolta del consenso informato dai soggetti partecipanti allo studio, verificheremo queste ipotesi mediante i seguenti approcci:1. Valutazione dell’espressione/attivazione delle RBPs nell’epitelio epitelio respiratorio di pazienti affetti da malattie croniche respiratorie e della sua potenziale correlazione con i quadri clinici. Acquisiremo mediante brushing nasale/bronchiale (in corso di rinoscopia/broncoscopia diagnostica) cellule epiteliali respiratorie isolate da pazienti (minimo n=15) con diagnosi di: a) rinosinusite cronica con poliposi (in pazienti cutipositivi ad almeno un aeroallergene; b) asma bronchiale allergico (in pazienti cutipositivi ad allergeni perenni e caratterizzati clinicamente per fenotipo secondo linee guida GINA); c) BPCO di grado lieve o moderato (caratterizzati clinicamente per fenotipo secondo linee guida GOLD). Tutti i gruppi saranno considerati prima e dopo una terapia con GC per os (prednisone 50 mg/die) condotta per due settimane (dopo wash-out di due settimane con beta-agonisti al bisogno) e considerati per lo studio dopo conferma clinica di risposta alla terapia. Appena raccolte, le cellule saranno lavate in buffer, esaminate per vitaltà, contate e suddivise in aliquote di circa 10,000 cellule/condizione. Una aliquota sara’ montata su vetrino per citocentrifugazione, per la identificazione immunoistochimica di marker epiteliali e la valutazione immunoistochimica dell’espressione di RBPs, unita alla determinazione morfologica mediante colorazione con ematossilina-eosina; Una seconda aliquota sarà utilizzata per la determinazione mediante real-time PCR dell’espressione delle tre RBPs e della loro modulazione da parte dei GC, da correlare con i livelli di mRNA di citochine infiammatorie regolate dalle RBP, valutate negli stessi campioni. 2. Valutazione dell’espressione di RBPs in PBMC e sua potenziale relazione con i quadri clinici considerati. Negli stessi soggetti verranno raccolti i PBMC secondo metodiche standard di separazione cellulare e che verranno caratterizzati su citocentrifugato mediante colorazione con ematossilina-eosina. Lo stato di espressione e di attivazione delle tre RBPs e l’effetto della terapia con GC sarà valutato mediante citofluorimetria, immunoistochimica, real-time PCR e Western blot e messo in correlazione con l’ espressione di geni infiammatori regolati dalle RBPs, nonchè con i parametri clinici dei donatori. Tutti i dati clinici e sperimentali saranno presentati come media ± errore standard (SEM) e valutati per significatività statistica (considerando significativo un valore della p < 0.05) con appropriati test non parametrici ed analisi post-hoc, utilizzando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, http://www.graphpad.com).