Alessandro WEISZ | Projects

ANALISI GENOMICA DELLA CARCINOGENESI ENDOMETRIALE

Partendo dall'evidenza che le conoscenze ad oggi disponibili sull’espressione dei lncRNA nell’endometrio umano normale e canceroso sono scarse e frammentarie, la presente ricerca si prefigge lo scopo di effettuare un’analisi comparativa dei livelli di espressione di tutti i lncRNA presenti in campioni di tessuto endometriale umano normale e patologico mediante tecnologie di sequenziamento massivo parallelo (standed RNA-Seq), seguite da analisi bioinformatiche volte a identificare anche RNA non annotati nelle banche dati di lncRNA. Poiche’ uno degli effetti noti di questi RNA regolatori e’ quello di modificare il livello di metilazione del DNA (Peschansky & Wahlestedt, 2014; Sabin et al., 2013), lo studio comprendera’ anche un’analisi dei livelli di metilazione globale del DNA mediante microarray (HumanMethylation450 BeadChip) e/o sequenziamento (RRBS-Seq), seguita da indagini bioinformatiche volte ad indentificare i bersagli genomici di lncRNA disregolati nei tumori che vadano incontro a variazioni dello stato di metilazione nel tessuto patologico all’endometrio sano della stessa paziente.La ricerca si articolerà in tre fasi, secondo il seguente piano di lavoro:1. Caratterizzazione dei profili di espressione degli lncRNA. Per questo, si ricercheranno i lncRNA differenzialmente espressi in tessuti tumorali rispetto al tessuto normale, prelevato in isteroscopia dalla stessa paziente, mediante stranded RNA-Seq, che consente anche l’identificazione di nuovi lncRNA e l’analisi degli RNA >200bp, ha un range dinamico di rilevamento molto ampio e premette di misurare differenze relativamente piccole di espressione tra campioni, rappresentando ad oggi la tecnologia più idonea per studi globali del trascrittoma, compresa l’individuazione ‘de novo’ di RNA ancora sconosciuti e costi più contenuti. La determinazione del profilo di espressione degli RNA verrà effettuata mediante NGS. Per questo, le librerie di acidi nucleici verranno sequenziate su Illumina NextSeq 500. 2. Identificazione di tutti gli RNA differenzialmente espressi in tessuti tumorali ed iperplastici rispetto al tessuto normale, seguita dalla ricerca ‘in silico’ dei lncRNA utilizzando le versioni piu’ aggiornate dei database LNCipedia (Volders et al, 2015), LncRBase (Chakraborty et al, 2014) e LncRNAWiki (Ma et al, 2015) per i lncRNA umani. In parallelo, utilizzando algoritmi di predizione, verranno condotte analisi delle sequenze ottenute per l'individuazione di nuovi lncRNA non ancora annotati, e/o di varianti di RNA noti presenti nel tessuto tumorale per eventi mutazionali. 3. Ricerca di possibili bersagli genomici di lncRNA che presentino livelli di espressione abnorme nel tessuto canceroso. Per questo si procedera’ all’analisi comparativa dei livelli di metilazione delle citosine nel DNA di ca endometriale rispetto a quello della controparte di endometrio normale della stessa paziente. Per questo di utilizeranno microarray che permettono la determinazione del grado di metilazione di 450.000 CpG o, in alternativa, Reduced Representation Bisulfite Sequencing (Fouse et al, 2010). I dati verranno analizzati utilizzando protocolli di analisi bioinformatiche gia’ in uso nel laboratorio proponente. - Cancer Genome Atlas Research Network. Nature 497:67, 2013.- Cech TR, Steitz JA. Cell 157:77, 2014.- Chakraborty S, et al. PLoS One 9:e108010, 2014.- Fouse et al. Epigenomics 2:105, 2010.- Ma L, et al. NAR 43:D187, 2015.- Peschansky VJ, Wahlestedt C. Epigenetics 9:3, 2014.- Ravo Met al. Oncotarget 6:4677, 2015.- Sabin LR, et al. Mol Cell 49:783, 2013.- Smith RA, et al. CA Cancer J Clin 64:30, 2014.- Volders PJ, et al. NAR 43:4363, 2015- Yang L, et al. Trends Biochem Sci 39:35, 2014.- Yarmishyn AA, Kurochkin IV. Front Genet 6:145, 2015.- Yeramian A, et al. Oncogene 32:403, 2013.