Mario VITALE | Projects

LA CHINASI CALCIO-CALMODULINA-DIPENDENTE (CAMKII) NEL CARCINOMA TIROIDEO.

Scopo di questa ricerca è determinare il ruolo di CaMKII nel tumore tiroideo di origine epiteliale e verificare se questa chinasi può essere utilizzata come bersaglio molecolare per la terapia con inibitori farmacologici specifici. In particolare, poiché abbiamo già dimostrato il ruolo di CaMKII nei tumori nei quali è presente l’oncogene RAS mutato, RET mutato e RET/PTC, vogliamo capire se anche l’oncogene BRAFV600E attiva CaMKII e se questa chinasi partecipa alla stimolazione della proliferazione e ha un ruolo nella sopravvivenza nelle cellule di PTC, FTC e UTC. L’oncogene BRAFV600E è quello più frequente nei PTC e la sua costante attività è necessaria per la sopravvivenza delle cellule che lo contengono. A tale scopo, determineremo mediante RT-PCR se e quali delle quatto isoforme di CaMKII sono espresse nella line cellulare BCPAP, un PTC portatore di BRAFV600E, nelle cellule TPC1 (portatrici dell’oncogene RET/PTC) e UTC (portatrici di altre mutazioni). Quindi, il livello di attività di CaMKII in queste cellule verrà determinato mediante saggio di chinasi. Verranno allestiti test di proliferazione (curve di proliferazione, incorporazione di timidina triziata, saggi di MTT e analisi del ciclo cellulare mediante citofluorimetria) e di sopravvivenza (western blot per caspasi-3, DNA ladder, analisi citofluorimentrica con annexina-V/ioduro di propidio). I test verranno effettuati su cellule BCPAP, TPC1 e UTC, trattate con l’inibitore farmacologico di CaMKII (K93) o un peptide inibitore specifico (antCantide). Per verificare che i fenomeni osservati sono dovuti all’oncogene BRAFV600E, l’espressione di questo verrà indotta in cellule di tiroide non tumorale (TAD2). La misura dell’attivazione di CaMKII verrà effettuata mediante saggio di chinasi, mentre gli esperimenti di inibizione verranno replicati con gli inibitori di CaMKII.L’inibizione della via delle MAPK e delle vie accessorie di CaMKII, oltre al blocco della proliferazione, potrebbe portare ad uno squilibrio tra sintesi di DNA e/o attivazione del ciclo cellulare e sintesi proteica. Questo squilibrio induce apoptosi. Questa ricerca presenta elementi di assoluta originalità, poiché il ruolo di CaMKII non è mai stato studiato nei tumori tiroidei, con la sola eccezione del ruolo in cellule con RET/PTC e RET mutato, effettuato dal nostro gruppo di ricerca. I risultati ottenuti sono molto incoraggianti poiché abbiamo evidenziato che l’inibizione di CaMKII nelle cellule portatrici di questi oncogeni induce arresto della crescita, e questo costituisce un buon presupposto per il quale venga indotta anche morte cellulare.