Mario VITALE | Projects

IGH E TCR¿ CLONALITY TESTING SU CAMPIONI CITOLOGICI CONSERVATI SU FTA CARDS

Fase 1: Cento sospensioni cellulari linfonodali relative a NHL monoclonali e processi reattivi policlonali, saranno raccolte in vivo da altrettanti pazienti afferenti alla AOU dell’ Università di Salerno mediante FNC linfonodale. Il materiale utilizzato sarà residuale a quello impiegato per diagnostica routinaria citologica e citofluorimetrica. I pazienti saranno informati dello studio e daranno loro assenso mediante firma di consenso informato. Lo studio è stato approvato dal Comitato etico Campania Sud. Sospensioni cellulari in 1000 µL of PBS saranno così ripartite: 600 µL saranno utilizzati per valutazione citofluorimetrica; I restanti 400 ¿L divisi in due aliquote di 240 µL crioconservati a -80°C e di 160 µL sospesi in FTA card. Le cards saranno quindi asciugate e conservate a temperatura ambiente in buste d’alluminio risigillabili fino all’ uso. Fase 2: Da due dischi di 3 mm per ciascuna card ottenuti mediante cutting-mat sarà eseguita estrazione del DNA. I dischi saranno posizionati in tubi sterili ed il DNA estratto direttamente utilizzando QIAamp® DNA Micro Kit” La procedura prevede inclusione e binding selettivo del DNA in membrane di silice e colonne QIAamp secondo procedure standard. Il DNA ottenuto sarà conservato a -20°C fino all’ uso e quantificato mediante NanoDrop 1000 V3.7.1 Spectrophotometer. 5 µL of eluto saranno utilizzati per analisi elettroforetica su 1% di gel di agarosio. Fase 3: L’ analisi IGHK/TCRBG PCR sarà eseguita su tutti i campioni e su controlli negativi coservati su FTA cards e criopreservati. Riarrangiamenti IGH VH–JH saranno identificati mediante tre sets di VH primers, corrispondenti a tre regioni VH FR (FR1, FR2, and FR3) ed un JH consensus primer, combinati in tre multiplex tubi (IGH A, IGH B e IGH C rispettivamente). La catena leggera IGK sarà valutata utilizzando due tubi: IGK A con Vk e Jk primers e IGK B con Vk, introne RSS e Kde primers. Saranno inoltre utilizzati 23 Vb primers, 13 Jb primers e due Db primers in tre tubi per valutare I riarrangiamenti di TCRB. IGHK/TCRBG PCR sarà eseguita usando GoTaq® . I prodotti PCR saranno denaturati a 95°C per 5 minuti. L’ analisi elettroforetica sarà eseguita in gel non denaturante di polyacrylamide gel 6% a 110V per 2 ore e visualizzata con 0.5¿g/ml of EtBr per 10 minuti. Fase 3: La clonalità IGHK/TCRBG BG sarà definita secondo le linee guida di EuroClonality/BIOMED-2. In particolare, monoclonalità sarà definita la presenza di 1 o 2 bande discrete e riproducibili di peso molecolare prestabilito per ciascun tubo. Policlonalità o assenza di clonalità sarà definita dallo smearing all’analisi HD. Fase 4. Un analisi statistica dei dati ottenuti sarà eseguita utilizzando Student-t test per dati appaiati per valutare eventuali differenze statistiche nei corrispondenti valori medi in quantità e qualità di DNA estratto da FTA cards e materiale criopreservato. Lo stesso test sarà eseguito comparando I risultatidella clonalità ottenuta con metodiche routinarie e quelli ottenuti mediante IGH/TCRG PCR su FTA cards, con lo scopo di validare quest’ultimo come supporto di supporto di preservazione e conservazione di materiale genetico, alternativo a quelli tradizionali in grado miniaturizzare ed ottimizzare la determinazione della clonalità. 13. Pubblicazioni scientifiche Ai fini della valutazione del presente progetto verranno considerate tutte le pubblicazioni dei partecipanti approvate a catalogo relativamente al triennio 2014-2015-2016.