Cristiana STELLATO | Progetti

RUOLO DELLA RNA-BINDING PROTEIN TRISTETRAPROLINA NEL MECCANISMO ANTIINFIAMMATORIO DEI GLUCOCORTICOIDI

Ipotizziamo che nelle cellule epiteliali e nelle cellule infiammatorie il trattamento con GC promuova l’espressione/attivazione di TTP e che tale azione: a) correli con la diminuzione di geni antiinfiammatori; b) correli con la diminuzione dell’infiltrazione di cellule infiammatorie nella mucosa respiratoria; c) correli con la coordinata degradazione dell’mRNA di geni proinfiammatori attraverso il controllo esercitato da TTP sulla loro espressione. Verificheremo queste ipotesi mediante tre obbiettivi. 1. Valutazione dell’espressione/attivazione di TTP in cellule primarie epiteliali della mucosa nasale e sua relazione con l’ infiammazione della mucosa nasale. Acquisiremo cellule primarie umane isolate da donatori sani e pazienti con rinosinusite cronica con poliposi (minimo n=5 per gruppo) (Prevete et al. J Biol Regul Homeost Agents. 2011;25:553, Salzano et al. Acta Otolaryngol. 2011;131:640) I soggetti seguiranno una terapia con GC topico per due settimane. Prima e dopo la terapia, le cellule saranno prelevate via nasal brushing e coltivate in vitro (~4 settimane). Il liquido di lavaggio nasale verra’ raccolto nei soggetti ed il citocentrifugato sara’ valutato con metodiche standard per caratterizzare le cellule infiammatorie. Le colture epiteliali saranno incubate per 24 h con mezzo di coltura (controllo) e con TNF ed IL-13 (20 ng/ml ognuno), documentati induttori dell’infiammazione allergica, in presenza di desametazone (DEX, 10-6 M) o del suo diluente, il dimetilsulfossido (DMSO). Parte delle cellule verra’ utilizzata per la determinazione immunoistochimica dei livelli di TTP totale e fosforilato (come indice di attivazione di TTP) usando specifici anticorpi disponibili commercialmente; una seconda aliquota verra’ utilizzata per l’estrazione dell’RNA e delle proteine secondo metodiche standard, su cui valutare l’espressione/attivazione di TTP e della sua modulazione da parte dei GC via real-time PCR e Western blot, nonche’ per correlare tale espressione con quella di citochine infiammatorie targets di TTP, valutate anche nel sopranatante cellulare (Fan et al. J.Immunol. 2011;186:2482; Ishmael et al. J Immunol 2011; 15:1189) 2. Valutazione dell’espressione di TTP in cellule infiammatorie e sua relazione con l’ infiammazione della mucosa bronchiale. Un simile approccio sara’ perseguito reclutando soggetti sani e con asma di grado moderato – selezionati secondo i criteri GINA - (minimo n=5 per gruppo) (Pelaia et al. Int J Clin Pharmacol Ther. 2011;49:713). In tali soggetti, prima e dopo terapia con GC sistemico condotta per due settimane verra’ raccolto l’espettorato indotto (induced sputum, IS) (Vatrella et al. Int J Immunopathol Pharmacol. 2010;23:745), l’esalato condensato (exhaled breath condensate, EBC) ed i leucociti del sangue periferico (perypheral blood mononuclear cells, PBMC) (Casolaro et al JACI 2008;121:853, Boin et al. Arthr & Rheum 2008;58:1165-1174, Granata et al. JI 2010;184:5232, Granata et al. Immunobiology. 2009;214:811), che verranno caratterizzate su citocentrifugato. L’RNA totale ed il lisato proteico cellulare saranno valutati riguardo l’effetto della terapia con GC su a) espressione/attivazione di TTP; b) correlazione con cellule infiammatorie ed espressione di geni infiammatori. 3. Valutazione dell’effetto della terapia con GC sulla stabilita’ dell’mRNA di geni regolati da TTP. In caso i dati sperimentali indichino una correlazione fra una aumentata espressione/attivazione di TTP indotta dala terapia con GC ed una diminuzione dei geni regolati da TTP, valuteremo in vitro se il trattamento con GC di colture di cellule epiteliali o infiammatorie provenienti dagli stessi pazienti modifichi l’espressione di tali geni accelerando la degradazione del loro mRNA, utilizzando un trattamento con actinomicina D (Stellato et al JI 2011;187:441). In caso positivo, si inibira’ l’ espressione di TTP mediante siRNA per verificare se sia necessaria e sufficiente per questo effetto.