Vincenzo CASOLARO | Projects

PRODUZIONE E RUOLO PATOGENETICO DI PROSTANOIDI PROINFIAMMATORI NELLA BRONCOPNEUMOPATIA CRONICA OSTRUTTIVA

Soggetti—Saranno reclutati 20 pazienti con BPCO di grado variabile, 20 fumatori non affetti da BPCO, e 20 soggetti di controllo di età confrontabile. A ciascuno sarà prelevato un campione di sangue venoso e di espettorato indotto mediante un nebulizzatore ultrasonico come descritto (Respiration 2009; 78: 209). Saranno inoltre ottenuti campioni di parenchima polmonare da 10 pazienti con BPCO e 10 controlli sottoposti a resezione chirurgica di carcinoma polmonare.Campioni—I neutrofili e le cellule mononucleate circolanti verranno separati mediante centrifugazione su gradiente di densità. L’espettorato indotto verrà processato in ditiotreitolo o mediante dispersione meccanica come descritto (PNAS 2008; 105: 4335), filtrato e separato mediante centrifugazione. Il parenchima polmonare, i bronchi e i linfonodi peribronchiali saranno dissezionati e a) fissati e inclusi in paraffina; b) conservati a 4°C in phosphate-buffered saline con sodio azide; o c) congelati in azoto liquido e conservati a -80°C; d) conservati in RNAlater (Ambion).Dosaggi—Lo studio sarà incentrato sull’identificazione e misurazione dei livelli di espressione del CD294 e dei due isozimi della PGDS, la PGDS ematopoietica (PGDS sensu stricto) e la PGDS lipocalin-like (PTGDS). Questi verranno riscontrati mediante un approccio combinato. L’espressione di superficie di CD294 verrà analizzata mediante citofluorimetria in cellule non fissate isolate da sangue periferico e dall’espettorato indotto. Le cellule CD294+ verranno caratterizzate mediante colorazione simultanea per marcatori specifici, come in particolare il CD66b (neutrofili), CD14 e CD68 (monociti e macrofagi), CD3 (linfociti T), FcepsilonRI (basofili e mastociti) ed altri. L’espressione di CD294 e degli isozimi della PGDS verranno inoltre analizzate mediante immunofluorescenza di sezioni congelate di parenchima polmonare o tessuto bronchiale, in particolare in associazione con marcatori specifici per i macrofagi e i neutrofili. In aggiunta ai marcatori suddetti verranno analizzati marcatori intracellulari come la mieloperossidasi e la proteinasi-3. Marcatori aggiuntivi includeranno la triptasi e la eosinophil cationic protein per l’identificazione rispettiva di mastociti ed eosinofili. Verrà inoltre impiegato un marcatore nucleare, come il DAPI e il TO-PRO3, per consentire una conta complessiva delle cellule presenti in ciascun campo. I risultati verranno infatti espressi in termini di percentuale di cellule CD294+ e/o PGDS+ relativamente al numero totale di cellule nucleate o che esprimano marcatori specifici. Per un’analisi quantitativa dell’espressione di questi analiti si ricorrerà all’estrazione di proteine e RNA da pellet cellulari e da campioni di tessuto freschi o conservati in RNAlater. Gli estratti verranno analizzati mediante Western blot, quantificato relativamente ad un controllo di alfa-tubulina mediante densitometria, ovvero mediante PCR quantitativa utilizzando primer specifici per ciascun analita e per la peptidil-prolil isomerasi A, utilizzata come controllo. Gli estratti inutilizzati verranno conservati per successive determinazioni, per esempio ibridizzazioni su chip Illumina per profili di espressione.Analisi statistica—Il livello di varianza tra i gruppi studiati sarà analizzato mediante ANOVA, e t test saranno utilizzati per identificare differenze significative tra il gruppo COPD e ciascuno dei gruppi di controllo. I dati di citofluorimetria ed immunofluorescenza saranno per lo più espressi come percentuali e prevedibilmente non saranno distribuiti normalmente. Pertanto, si prevede di utilizzare algoritmi non parametrici, come il Kruskal-Wallis e il Mann-Whitney. Considerata la natura esplorativa di questi studi, non riteniamo dirimente una power analysis formale. Tuttavia, sulla base di studi precedenti condotti con variabili analoghe, riteniamo che il numero di soggetti sia più che sufficiente a garantire un livello soddisfacente di potere statistico.