Vincenzo CASOLARO | Progetti

RUOLO DELLE RNA-BINDING PROTEINS HUR E TRISTETRAPROLINA NELL¿INFIAMMAZIONE ALLERGICA E NEL MECCANISMO ANTIINFIAMMATORIO DEI GLUCOCORTICOIDI

Ipotizziamo che nelle cellule epiteliali respiratorie e nelle cellule infiammatorie di pazienti con patologie immuno-allergologiche vi siano alterazioni dei livelli e/o dello stato di attivazione di HuR e di TTP, e che il trattamento con GC promuova un rimodellamento della configurazione di RBP tale da favorire la funzione degradatrice di TTP. Ipotizziamo che tale azione: a) correli con la diminuzione di geni antiinfiammatori; b) correli con la diminuzione dell’infiltrazione di cellule infiammatorie nella mucosa respiratoria; c) correli con un cambiamento quantitativo e qualitativo nell’associazione di RBP ai trascritti infiammatori, con una preponderante presenza di HuR in fase infiammatoria e di TTP dopo trattamento con GC. Verificheremo queste ipotesi mediante tre obbiettivi. 1. Valutazione dell’espressione/attivazione di TTP e di HuR in cellule primarie epiteliali della mucosa nasale e sua relazione con l’ infiammazione della mucosa nasale. Acquisiremo cellule primarie umane isolate pazienti con rinosinusite cronica con poliposi (n=10) (Prevete et al. J Biol Regul Homeost Agents. 2011;25:553). Prima e dopo una terapia con GC topico per due settimane, le cellule saranno prelevate via nasal brushing e coltivate in vitro (~4 settimane). Le colture epiteliali saranno incubate per 24 h con mezzo di coltura (controllo) e con TNF ed IL-13 (20 ng/ml ognuno) in presenza di desametazone (DEX, 10-6 M) o del diluente dimetilsulfossido (DMSO). Seguirà la determinazione immunoistochimica di HuR e TTP totale e fosforilato (come indice di attivazione) e dell’espressione/attivazione di HuR e TTP e della loro modulazione da parte dei GC via real-time PCR e Western blot, da correlare con i livelli di citochine infiammatorie targets delle due RBP valutate nel sopranatante cellulare (Fan et al. J.Immunol. 2011;186:2482; Ishmael et al. J Immunol 2011; 15:1189) 2. Valutazione dell’espressione di RBP in cellule infiammatorie e sua relazione con l’ infiammazione della mucosa bronchiale. Un simile approccio sara’ seguito in soggetti con asma di grado lieve-moderato –secondo i criteri GINA – in pazienti cutipositivi ad allergeni perenni (n=10) (Pelaia et al. Int J Clin Pharmacol Ther. 2011;49:713). Prima e dopo terapia con GC sistemico condotta per due settimane (dopo wash-out di due settimane con beta-agonisti al bisogno) verra’ raccolto l’espettorato indotto (induced sputum, IS) (Vatrella et al. Int J Immunopathol Pharmacol. 2010;23:745), l’esalato condensato (exhaled breath condensate, EBC) ed i leucociti del sangue periferico (perypheral blood mononuclear cells, PBMC) (Casolaro et al JACI 2008;121:853, Granata et al. JI 2010;184:5232), che verranno caratterizzati su citocentrifugato. L’effetto della terapia con GC sarà valutato su a) espressione/attivazione di HuR e TTP; b) correlazione con cellule infiammatorie ed espressione di geni infiammatori regolati da HuR e TTP. 3. Valutazione della associazione di RBP sui trascritti di geni target prima e dopo terapia con GC. Valuteremo se il trattamento con GC di cellule epiteliali o infiammatorie provenienti dagli stessi pazienti modifichi l’associazione delle due RBP su trascritti selezionati, mediante tecnica di biotin pull-down (Ishmael et al. J Immunol 2011; 15:1189). In caso positivo, si inibira’ l’ espressione di TTP mediante siRNA per verificare se sia necessaria e sufficiente per questo effetto.