Vincenzo CASOLARO | Progetti

REGOLAZIONE DELL¿ESPRESSIONE DI CD154 NELLE CELLULE TH2 UMANE DA PARTE DELL¿ASPIRINA

Un limite degli studi finora condotti è costituito dal modello sperimentale, che analogamente a studi precedenti su modelli umani o murini ha analizzato il fenotipo di cellule generate in colture polarizzanti, nelle quali precursori naive sono stimolati con mitogeni in presenza di citochine ricombinanti ed anticorpi bloccanti. In questo modello, cellule con fenotipo Th2 sono generate mediante incubazione con IL-4 e anticorpi anti-interferone-gamma, una semplificazione sperimentale che non necessariamente riproduce le condizioni che portano alla differenziazione di queste cellule in vivo. È noto infatti che il microambiente che conduce alla differenziazione Th2 è particolarmente complesso e si avvale del contributo variabile di citochine e molecole costimolatrici di derivazione mieloide o epiteliale, quali il TSLP, la IL-25 e OX40, non facilmente riproducibile in modelli in vitro. La caratterizzazione di CD294, prodotto del gene GPR44 anche noto come CRTH2, come marcatore selettivo delle cellule Th2 umane consente in buona parte di superare queste limitazioni. Da un’indagine preliminare abbiamo apprezzato che il fenotipo delle cellule Th CD294+ isolate dal pool periferico di volontari differisce significativamente da quello di cellule generate in vitro da precursori naive dagli stessi donatori, ed è marcatamente più stabile, mantenendosi sostanzialmente immutato dopo diverse settimane in coltura. Riteniamo pertanto opportuno estendere le nostre osservazioni ed analizzare l’effetto immunomodulante dell’ASA su cloni e linee Th derivati da cellule già differenziate presenti nel sangue periferico.Per fare ciò utilizzeremo un protocollo di separazione magnetica sequenziale che sfrutterà le potenzialità della strumentazione MultiMACS Cell24 (Miltenyi) recentemente acquisita dal nostro Dipartimento. In breve, cellule T circolanti CD4+CD45RO+ (effector/memory) verranno separate per selezione negativa utilizzando un cocktail di anticorpi specifici per marcatori di linea, quindi separate in due frazioni mediante selezione positiva di cellule CD294+. Queste saranno stimolate settimanalmente con anticorpi immobilizzati anti-CD3 e -CD28, e restimolate previo pretrattatamento (15 min) con ASA, altri FANS e appropriati controlli. La produzione di citochine verrà misurata mediante ELISA e l’espressione di CD154 ed altri marcatori di membrana mediante citofluorimetria. L’espressione e la localizzazione di NFAT verrà valutata mediante Western blot di estratti frazionati ed immunofluorescenza. Questi dati verranno confrontati con quelli ottenuti in popolazioni CD4+CD45RO+CD294- dagli stessi donatori, che conterranno prevalentemente cellule con fenotipo Th1 ed in misura minore Th17 e Treg. Questi esperimenti consentiranno di verificare se l’ASA sia in grado di esercitare effetti dipendenti dalla polarizzazione del fenotipo Th, ivi compreso un possibile effetto differenziale sulla funzione di NFAT. Analoghi esperimenti verranno condotti su cellule isolate da pazienti con asma o rinite allergica persistenti, nei quali abbiamo documentato un aumento della frequenza di cellule Th CD294+ non proporzionale all’aumento, ben più marcato, della produzione di IL-4 indotta da mitogeni ex vivo. Questo modello sperimentale potrebbe contribuire ad identificare alterazioni fenotipiche e funzionali di queste cellule associate con, e verosimilmente causative delle patologie allergiche in questi pazienti. Un terzo gruppo di donatori sarà costituito da pazienti con AERD, una patologia Th2-dipendente caratterizzata da intolleranza all’ASA ed asma di grado moderato-severo associato con poliposi rinosinusale resistente al trattamento medico-chirurgico. I sintomi di questa condizione sono controllati dalla somministrazione di dosi elevate di ASA (desensibilizzazione). Riteniamo pertanto che la valutazione degli effetti in vitro del farmaco sulle cellule Th2 di questi pazienti potrebbe contribuire ad identificare possibili biomarcatori di interesse diagnostico e terapeutico.