Giovanni NASSA | Progetti

RUOLO DEI MICRORNA NELLA MODULAZIONE DELL'ATTIVAZIONE PIASTRINICA IN PAZIENTI AFFETTI DA SINDROME CORONARICA ACUTA

La ricerca si articolera’ in quattro fasi, secondo il seguente piano di lavoro:1. Caratterizzazione dei profili di espressione dei miRNA nelle piastrine durante l'attivazione ‘in vitro’. A questo fine, si cercheranno miRNA differenzialmente espressi in piastrine attivate vs controllo mediante miRNA-Seq, che permette anche l’identificazione di nuovi miRNA piastrino-specifici e di altri piccoli RNA non codificanti (piRNA, tiRNA, snoRNA, ecc). La determinazione del profilo di espressione del miRNoma verrà effettuata mediante sequenziamento di nuova generazione. Per questo, librerie di acidi nucleici generate per ciascun campione da studiare verranno analizzate sui sequenziatori ad elevate prestazioni HiSeq1500 e Ion Torrent PGM. Questa tecnologia di sequenziamento ad alta produttività, che consente una range dinamico di rilevamento molto ampio e la possibilita’ di misurare differenze relativamente piccole di espressione tra campioni, rappresenta il metodo ad oggi piu’ idoneo per studi del miRNoma poiché offre molti vantaggi rispetto ai microarray, tra cui una maggiore sensibilità, più ampio spettro di RNA che può venire analizzato, capacità di sequenziamento ‘de novo’ di RNA ancora sconosciuti e costi piu' contenuti. Lo studio verra’ eseguito inizialmente su piastrine isolate da donatori sani, mentre in una seconda fase da piastrine provenienti da pazienti colpiti da ACS; 2. Identificazione di tutti gli RNA messaggeri e non codificanti (long non-coding) espressi nelle piastrine prima e dopo attivazione mediante RNA-Seq, seguita dalla ricerca ‘in silico’ degli RNA bersaglio di miRNA mediante strumenti bioinformatici. Per convalidare i potenziali bersagli di miRNA identificati computazionalmente, verra’ eseguita l’immunoprecipitazione dei polisomi con anticorpi diretti contro le proteine Argonauta, fattori chiave nella maturazione dei miRNA e nel loro legame ai mRNA bersaglio nei polisomi, seguita da sequenziamento di tutti gli acidi nucleici cosi' ottenuti (RIP-Seq);3. Utilizzo della proteomica quantitativa (iTRAQ) per analisi del proteoma delle piastrine prima e dopo attivazione ‘in vitro’. Questo approccio, combinato con quelli su descritti, permetterà l'identificazione di proteine piastriniche i cui livelli di espressione variano significativamente durante l’attivazione, collegando direttamente la risposta di mRNA e miRNA alle variazioni di livello/attività del proteoma, fornendo un profilo molecolare che spieghi le variazioni di funzione che avvengono nelle piastrine nel corso di questa risposta;4. Verifica della possibilita’ che miRNA e altri piccoli RNA non codificanti vengano rilasciati selettivamente dalle piastrine durante l'attivazione e siano quindi misurabili nel plasma. Per questo gli acidi nucleici presenti nel plasma nel quale sono immerse le piastrine durante le fasi di attivazione ‘in vitro’ verranno analizzati mediante sequenziamento, come descritto in precedenza. In base ai risultati ottenuti, si procedera’ anche all’analisi di sieri ottenuti da pazienti colpiti da ACS; I risultati attesi permetteranno di ottenere per la prima volta una catalogazione completa di miRNA, mRNA e proteine i cui livelli variano in corso di attivazione piastrinica. Grazie all’approccio sperimentale ed analitico adottato, queste informazioni potranno venir integrate in pathway di regolazione e funzione mediate l’utilizzo di strumenti bioinformatici (KEGG, IPA, ecc.), fornendo una base di dati utile per identificare processi di attivazione piastrinica latente o nelle primissime fasi di evoluzione della ACS. Inoltre, l’identificazione di piccoli RNA non codificanti liberati dalle piastrine durante questo processo potra’ rappresentare il punto di partenza per la messa a punti di nuovi biomarcatori multiparametrici in grado di misurare lo stato di attivazione piastrinica ‘in vivo’ in varie condizioni fisiologiche e patologiche ed a seguito di trattamenti farmacologici.