Francesco Antonio SALZANO | Projects

REGOLAZIONE POSTTRASCRIZIONALE NELL'EPITELIO RESPIRATORIO IN PATOLOGIE INFIAMMATORIE E ALLERGICHE

Ipotizziamo che nelle cellule epiteliali respiratorie e nelle cellule mononucleate di pazienti con patologie immuno-allergologiche vi siano alterazioni della regolazione posttrascrizionale rintracciabili nei livelli e/o nello stato di attivazione di due importanti RBP, HuR e di TTP, e nei livelli di espressione di sncRNA, e che il trattamento con GC promuova una modulazione di espressione e funzionalità di queste molecole tale da favorire la risoluzione dell’infiammazione. Ipotizziamo che tali azioni correlino con la diminuzione di espressione geni infiammatori epiteliali ed il miglioramento dei parametri clinici e della funzionalità respiratoria in risposta alla terapia. Verificheremo queste ipotesi mediante tre obbiettivi. 1. Valutazione dell’espressione/attivazione di sncRNA, di TTP e di HuR in cellule primarie epiteliali respiratorie e nel sangue periferico di pazienti con allergopatie respiratorie; 2. Effetto di un corso di terapia standard con GC sui suddetti parametri;3. correlazione con indici clinici di malattia e di risposta alla terapia. In particolare, previa approvazione del protocollo di ricerca da parte del comitato etico e raccolta del consenso informato, acquisiremo cellule primarie umane isolate via brushing nasale da pazienti cutipositivi ad allergeni perenni (n=10) con rinosinusite ed asma di grado lieve-moderato secondo i criteri ARIA e GINA (Int J Clin Pharmacol Ther. 2011;49:713), raccolte prima e dopo terapia con GC sistemico condotta per due settimane (dopo wash-out di due settimane con beta-agonisti al bisogno). I pazienti saranno fenotipizzati clinicamente e verranno raccolti gli indici di funzionalità respiratoria prima e dopo la terapia con GC. Verranno raccolti i leucociti del sangue periferico (perypheral blood mononuclear cells, PBMC) (JACI 2008;121:853, JI 2010;184:5232), che verranno caratterizzati su citocentrifugato e di cui si isolerà l’RNA totale per studi di espressione di lncRNA da effettuare sulla base dei risultati ottenuti sulle cellule epiteliali. Le cellule epiteliali (usualmente si recuperano 0,5-1 milione di cellule con 3-4 prelievi bilaterali) saranno valutate a fresco, per la determinazione in immunofluorescenza dell’espressione di HuR e TTP e per l’isolamento di RNA per l’RNAseq e l’analisi del trascrittoma, da eseguire presso Laboratorio di Medicina Molecolare e Genetica del Dipartimento di Medicina di Salerno ed elaborati utilizzando modelli statistici e bioinformatici correnti e disponibili in sede. Quando il numero di cellule epiteliali raccolte lo permetta, saranno disposte colture in vitro (~4 settimane) in piastre da 6 pozzetti. Le colture epiteliali in sub-confluenza saranno incubate per 24 h con mezzo di coltura (controllo) e con TNF¿ ed IL-13 (20 ng/ml ognuno) in presenza di desametazone (DEX, 10-6 M) o del diluente dimetilsulfossido (DMSO). Seguirà la determinazione in immunofluorescenza di HuR e TTP e dell’espressione/attivazione di HuR e TTP e dellaloro modulazione da parte dei GC via real-time PCR e Western blot (usando in quest’ultimo caso anticorpi specifici per la proteina totale e fosforilata come indice di attivazione), da correlare con i livelli di citochine targets delle due RBP valutate nel sopranatante cellulare (J.Immunol. 2011;186:2482, J Immunol 2011; 15:1189). L’espressione dei sncRNA nelle cellule epiteliali in coltura verra’ valutata in validazione e confronto con il profilo ottenuto nelle cellule epiteliali analizzate subito dopo la raccolta.