Mario MASARONE | Progetti

ANALISI METABOLOMICA NEI PAZIENTI CON NAFLD: IL PESO DI STEATOSI, STEATOEPATITE E CARCINOMA EPATOCELLULARE

La sperimentazione ha disegno osservazionale, caso controllo, trasversale, multicentrico.Essa risulta articolata in tre fasi: Fase 1: arruolamento e raccolta dei dati di pazienti selezionati ed individui sani: saranno arruolati pazienti affetti da NAFLD,che abbiano effettuato o che siano candidati ad essere sottoposti ad una biopsia epatica.Sarà inoltre arruolata una coorte di individui sani,come gruppo di controllo.Fase 2: raccolta dei campioni biologici per ogni paziente e per ogni volontario sano arruolato, sarà effettuato un prelievo ematico.fase 3: analisi dei campioni biologici: i campioni saranno sottoposti ad analisi gas cromatografiche e di spettrometria di massa allo scopo di determinarne il profilo metabolico. L'estrazione, la purificazione e la derivatizzazione dei metaboliti avverranno utilizzando il kit MetaboPrep GC (Theoreo, Montecorvino Pugliano, Italia). Le analisi strumentali avverranno utilizzando un sistema GC-MS (gascromatografo GC-2010 Plus accoppiato ad uno spettrometro di massa quadripolare QP2010 Plus, Shimadzu Corp., Kyoto, Giappone). I campioni saranno sottoposti anche ad analisi genetiche, per valutare la presenza polimorfismi a singolo nucleotide, associati ad un rischio maggiore di insorgenza di NAFLD. In particolare la determinazione dei genotipi rs58542926(TM6SF2E167K), rs738409(PNPLA3 I148M) e rs641738(MBOAT7/TMC4) avverrà utilizzando l'Illumina Infinium HumanExome BeadChip, come descritto in letteratura.Il numero totale di soggetti da arruolare è di 300, tra pazienti e controlli. In particolare saranno arruolati 60 pazienti per gruppo per ciascuno dei cinque gruppi:GRUPPO 1.Steatosi semplice non associata al consumo di alcol (NAFL);GRUPPO 2.Steato-epatite non associata al consumo di alcol (NASH);GRUPPO 3.Cirrosi insorta su steatosi non associata al consumo di alcol;GRUPPO 4.Carcinoma epatocellulare associato a steatoepatite non associata al consumo di alcol(NASH-HCC);GRUPPO 5.Controlli. Allo scopo di identificare la corretta numerosità campionaria, è stato eseguito uno studio pilota basato su 13 casi: 3 affetti da NAFLD, 4 da NASH, 3 da cirrosi e 3 con steatoepatite criptogenetica. Questi sono stati utilizzati per verificare l'ipotesi preliminare che la firma metabolica possa consentire una separazione tra tali classi. Ciò ci ha permesso di stimare in 60 pazienti per gruppo una dimensione campionaria adeguata per classificare i pazienti con NAFL con un FDR (False Discovery Rate) di 0,1. Criteri di inclusione: Età compresa tra i 18-80 anni;Firma del consenso informato; NAFLD diagnosticata per mezzo di biopsia epatica.Criteri di esclusione: Storia pregressa o attuale suggestiva di alcolismo; Epatopatia di origine virale; Neoplasie pregresse o attuali clinicamente documentate.I pazienti ed i controlli saranno stratificati per età, sesso e BMI. I pazienti saranno catalogati sulla base della presenza, all’istologia epatica, di steatosi o di steatoepatite;e per l'eventuale presenza di carcinoma epatocellulare, valutato da almeno due tecniche di imaging concordanti.Di ogni paziente (e controllo) saranno registrati dati antropometrici (peso,BMI, circonferenza vita), clinici(anamnesi esame obiettivo, parametri sindrome metabolica), bioumorali, di imaging (fibroscan, ecografia addome, TC, risonanza) ed istologici effettuati durante il normale workup clinico dei soggetti arruolati.L'analisi statistica multivariata (PLS-DA) verrà eseguita sui cromatogrammi normalizzati e corretti (sull'area di picco dello standard interno) usando il software R (Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria). Per tutte le analisi i dati saranno scalati centrando la media e ponendo la varianza come uguale a 1. A nostra conoscenza,esistono pochissimi studi di metabolomica nella NAFLD, condotti su piccoli campioni che hanno valutato un profilo solo parziale della NAFLD.Pertanto,tale approccio è,a nostro avviso, utile ed innovativo nel campo di una patologia di grande attualità come la NAFLD.