Ornella MOLTEDO | Progetti

TRAFFICO VESCICOLARE IN MODELLI CELLULARI DI PATOLOGIE NEURODEGENERATIVE

Allo scopo di individuare difetti morfo-funzionali del pathway secretorio riconducibili ad alterazioni dei PInP causate dall’espressione della proteina SYNJ1 mutata (R288Q) sono stati prodotti due modelli cellulari: cellule Hela nelle quali l'espressione del gene è stata interferita mediante shRNA specifici e linee di fibroblasti primari stabilizzati a partire dai pazienti affetti, omozigoti per la mutazione R288Q. Risultati preliminari hanno evidenziato nelle cellule Hela interferite per SYNJ1 un difetto dell’export dal RE di proteine secretorie neo-sintetizzate come il collagene IV che risulta essere ritenuto nel RE. Inoltre, in entrambi i modelli cellulari sono presenti significative alterazioni della struttura dei compartimenti precoci del pathway secretorio e difetti nel traffico vescicolare fra RE e Golgi. Poiché quest’ultime condizioni sono associate alla generazione dello Stress del RE, primo obiettivo del progetto è analizzare lo stato di attivazione dello stress del RE e della risposta adattativa che la cellula attiva in seguito allo stress, nota come Unfolded Protein Response (UPR). L’UPR è un sistema di signaling attivato dal RE e che ha lo scopo di ricostituire l’omeostasi proteica del pathway secretorio, attivando in ultimo anche processi di morte apoptotica che in molte patologie degenerative contribuiscono ad esacerbare il fenotipo patologico. Pertanto, allo scopo di valutare l’esistenza di una risposta UPR nei modelli prodotti verrà analizzato lo stato di attivazione dei trasduttori noti dell’UPR, IRE1, PERK, ATF6 e Bip/Grp78. L’attivazione di ATF6 e Bip/Grp78 verrà valutata mediante Western Blotting (WB) mentre l’attivazione di IRE1 verrà valutata in reazioni di RT-PCR rilevando il rate di splicing dell’mRNA codificante per la proteina XBP1 (target dell’attività endoribonucleasica di IRE1 attivo). L’attivazione di PERK verrà analizzata misurando mediante WB la fosforilazione del suo target eIF2alpha. Parallelamente, l’eventuale apoptosi indotta dall’UPR verrà misurata analizzando i livelli delle proteine pro-apoptotiche CHOP e caspasi-12 sia mediante WB che Real-Time PCR. E’ noto in letteratura che lo stress del RE e lo stress ossidativo sono spesso correlati tra loro in un “circolo vizioso” che prende il nome di “Integrated Stress Response” (ISR) sia perché il folding delle proteine secretorie nel lume del RE genera come prodotto di scarto specie reattive dell’ossigeno (ROS) che a loro volta inducono stress ossidativo, sia perché l’UPR può attivarsi come meccanismo di risposta all’alterazione dell’equilibrio redox cellulare. Pertanto, allo scopo di valutare l’attivazione dello stress ossidativo nei modelli sperimentali prodotti, verranno effettuati saggi enzimatici finalizzati a misurare da una parte l’attività della NADPH ossidasi e dall’altra i livelli di ROS intracellulare. Parallelamente, verrà analizzato il livello di attivazione dell’Eme Ossigenasi-1 (HO-1) e del fattore trascrizionale NRF2, entrambi inducibili dallo stress ossidativo, sia mediante WB che mediante Real-Time PCR. In aggiunta, poiché sia lo stress ossidativo che l’UPR convergono sull’up-regolazione del fattore trascrizionale ATF4 che è responsabile della trascrizione dei geni pro-apototici, l’induzione di quest’ultimo verrà misurata sempre mediante WB e Real-Time PCR. Infine, dopo avere caratterizzato lo stato di attivazione dello stress ossidativo e dell’UPR nei modelli sperimentali prodotti sarà interessante analizzare come l’eventuale impiego di inibitori dell’UPR o di agenti antiossidanti possa indurre una reversione dei meccanismi descritti allo scopo di testare possibili approcci terapeutici.