Ivana CAPUTO | Projects

RELAZIONE TRA PROTEINE DEL GLUTINE, TRANSGLUTAMINASI E AUTOANTICORPI ANTI-ANTRANSGLUTAMINASI NELLA PATOGENESI DELLA CELIACHIA

Nell'ambito del progetto si metterà a punto una procedura per l'isolamento di una (o più) proteina di membrana, con funzione recettoriale, responsabile dell'uptake del p31-43 nelle cellule Caco-2, cellule di adenocarcinoma umano, già impiegate come modello di studio per l'internalizzazione e l'attività biologica del p31-43 (Caputo et al. Biochim. Biophys. Acta 2010; Caputo et al. Plos One 2012). La strategia che si intende adottare prevede l'impiego di un anticorpo contro il p31-43, specificamente prodotto in coniglio, per isolare, mediante immunoprecipitazione, proteine di membrana che interagiscono con il p31-43. Per rendere stabile tale interazione si farà uso di un agente chimico "cross-linkante" commercialmente disponibile. Lo step del cross-linking deve essere realizzato sulle cellule vitali con lo scopo di stabilizzare un eventuale legame con la proteina recettore, legame che potrebbe essere troppo labile per essere mantenuto durante i passaggi successivi di purificazione. Per il pull-down dell'ipotetico recettore si utilizzeranno gli anticorpi anti-p31-43 preventivamente coniugati a particelle magnetiche. Gli eventuali complessi tra il peptide e le proteine di membrana verranno visualizzati in seguito ad elettroforesi in gel di poliacrilammide denaturante (SDS-page), mono- o bi-dimensionale, e colorazione con blue di Coomassie e/o mediante western blot. I complessi visualizzati potranno essere sottoposti ad un'analisi di spettrometria di massa allo scopo di identificare la proteina presente nel complesso, che potrebbe quindi rappresentare il recettore per l'uptake del p31-43.Contemporaneamente si valuterà anche l'ipotesi che la stessa TG2 di membrana possa essere una proteina coinvolta nell'interazione diretta con il p31-43; infatti anticorpi anti-TG2 possono influenzare negativamente l'uptake di questo peptide da parte delle cellule Caco-2 (Caputo et al. Biochim. Biophys. Acta 2010). La presenza di complessi TG2-p31-43, stabilizzati o meno dal cross-linking chimico, verrà quindi investigata mediante tecniche di immunoprecipitazione e successivo western blot. L'impiego anche di una linea cellulare con bassi livelli di TG2 consentirà di meglio valutare il ruolo della proteina nell'uptake del p31-43. La presenza di un recettore per il p31-43 verrà infine confermata o meno mediante esperimenti di competizione a diversi tempi tra il peptide "freddo" e il peptide marcato con fluoroforo, utilizzando la microscopia confocale.