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Pia RAGNO Projects

RUOLO DEL RECETTORE DELL'UROCHINASI E DEI SUOI PARTNERS DI SEGNALE NELLA MIGRAZIONE DI CELLULE TUMORALI

Lo studio sarà effettuato su cellule di carcinoma di prostata (PC3), dotate di elevato potenziale invasivo e caratterizzate da un’elevata espressione di uPAR. Al fine di esaminare l’importanza dell’uPAR nella migrazione di tali cellule, verranno effettuati saggi di migrazione verso siero in camera di Boyden, in presenza di anticorpi diretti contro l’uPAR o in seguito a silenziamento dell’espressione di uPAR tramite utilizzo di siRNA specifici. Il blocco o meno della migrazione chiarirà innanzitutto se l’espressione di uPAR è requisito indispensabile per la migrazione della cellula tumorale o meno. Successivamente, sarà valutata l’importanza delle interazioni dell’uPAR nella sua eventuale funzione regolatoria. Sarà valutata l’espressione di tutti e tre i fMLF-Rs e delle integrine beta1 tramite Western blot con anticorpi specifici. Saranno poi condotti saggi di migrazione cellulare verso siero in camera di Boyden in presenza di peptidi o di piccole molecole organiche in grado di annullare specificamente l’interazione dell’uPAR con interattori di membrana. A tal fine saranno utilizzati il peptide P-25, omologo a regioni di integrine beta1/beta2, che inibisce l’interazione dell’uPAR con le integrine stesse, e il composto 6, piccola molecola organica recentemente identificata, in grado di bloccare l’interazione dell’uPAR con fMLF-Rs. Saggi di chemiotassi verranno inoltre effettuati con cellule PC3 pre-trattate con peptide W, ligando di tutti e tre i fMLF-Rs, il pre-trattamento, infatti, inducendo la desensibilizzazione, con conseguente internalizzazione, dei recettori, indirettamente impedirebbe l’interazione dell’uPAR con fMLF-Rs. Successivamente, per comprendere meglio le dinamiche delle interazioni dell’uPAR e collegarle con i loro effetti sulla migrazione, sarà valutata la co-localizzazione in membrana dei tre recettori (uPAR, integrine beta1 e fMLF-Rs) mediante saggi di fluorescenza. In particolare, le cellule saranno stimolate con siero in presenza o meno del peptide P-25 e incubate con anticorpi specifici per uPAR e fMLF-Rs marcati con diversi fluorofori, oppure saranno stimolate con siero in presenza o meno del composto 6 e incubate con anticorpi specifici per uPAR e integrine beta1 marcati con diversi fluorofori. Dall’analisi al microscopio a fluorescenza sarà quindi possibile capire se l’uPAR prende connessione direttamente con ambedue i suoi partners oppure se agisce da ligando endogeno per fMLF-Rs e, in seguito a tale interazione, interagisce con le integrine, e, probabilmente, le trans-attiva.Una volta stabilita l’importanza dell’espressione dell’uPAR e delle sue interazioni, i saggi di migrazione saranno effettuati anche i presenza di inibitori di specifici mediatori di segnale, con particolare riferimento a mediatori il cui coinvolgimento con vie di segnalazione attivate dall’uPAR sia stato già riportato in letteratura. Tali esperimenti potrebbero contribuire a chiarire in quale modo l’uPAR potrebbe interferire o addirittura controllare i meccanismi di migrazione della cellula tumorale.L’uPAR ha indubbiamente un ruolo estremamente importante nelle varie fasi della cancerogenesi e della progressione tumorale. La comprensione dei meccanismi molecolari che permettono all’uPAR di controllare la migrazione della cellula tumorale può contribuire a chiarire meglio il ruolo dell’uPAR nella biologia del tumore e a ideare nuove strategie antitumorali mirate che possano avere come bersaglio tale recettore.

DepartmentDipartimento di Chimica e Biologia "Adolfo Zambelli"/DCB
FundingUniversity funds
FundersUniversità  degli Studi di SALERNO
Cost4.060,91 euro
Project duration28 July 2015 - 28 July 2017
Research TeamRAGNO Pia (Project Coordinator)
CARICATI ANTONELLA (Researcher)
FESTA AGOSTINO (Researcher)
LI SANTI ANNA (Researcher)
PISCOPO CHIARA (Researcher)