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CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DELLA DEACETILASI ISTONICA HST3P DI CANDIDA ALBICANS

PIANO SPERIMENTALEMateriali: per la realizzazione del progetto saranno utilizzati il ceppo wild-type SC5314 e i ceppi resistenti al fluconazolo ATCC 64124 e ATCC MYA 574-GU5 di C. albicans. I diversi ceppi di Candida saranno cresciuti in diversi terreni di coltura (RPMI, YNB, YPD), a diverse temperature e pH, in presenza di inibitori (NAM) e attivatori (NAD) delle sirtuine e/o di alcuni agenti antifungini (fluconazolo) per poter studiare i fenomeni di duplicazione, germinazione e di formazione di ife. Essendo ogni stadio morfologico la conseguenza di una specifica trascrizione genica, per ciascun ceppo di Candida verrà analizzata l’espressione di geni specifici. Metodi: -esperimenti di Real-Time PCR consentiranno di definire i livelli di espressione di geni coinvolti nello switching fenotipico e di individuare alterazioni della loro espressione in presenza di inibitori di Hst3p e/o dei convenzionali antifungini-il livello di acetilazione di H3K56 associato ai diversi stadi morfogenetici sarà determinato tramite Western Blot;-utilizzando oligonucleotidi specifici, sarà amplificata la sequenza di HST3a partire dal DNA del ceppo wild type di Candida; il prodotto di PCR sarà clonato in un vettore di espressione; individuate le condizioni ottimali di espressione, successivamente,si potrà procedere con l’espressione della proteina ricombinante fusa ad un opportuno tag per facilitarne la purificazione tramite cromatografia d’affinità. Qualora, dopo questo primo step di purificazione, il grado di purificazione non sarà accettabile, verranno effettuati ulteriori passaggi cromatografici (scambio ionico, gel filtrazione, etc.);-l’attività enzimatica della proteina purificata sarà valutata tramite saggi enzimatici con l’obiettivo di identificare potenziali inibitori da utilizzare come molecole antifungine (la messa a punto del saggio potrebbe prevedere l’utilizzo della metodica Alpha Screen);-saranno identificati potenziali target della deacetilasi Hst3p tramite esperimenti di Immunoprecipitazone cromatinica (ChIP) utilizzando oligo specifici per l’amplificazione della sequenza di DNA a cui si pensa sia legata la proteina di interesse. Un approccio alternativo, invece, potrebbe essere rappresentato dalla ChIP-on-ChIP, tecnica che ci consentirebbe di individuare nuovi promotori target.RISULTATI ATTESITale progetto consentirà di individuare una correlazione tra i livelli di H3K56ac e la regolazione dell’espressione di geni che governano lo switching fenotipico e la virulenza del fungo dimorfico C. albicans. Inoltre, essendo la modulazione dei livelli di H3K56ac una potenziale strategia per il trattamento delle candidosi, la selezione tramite saggio enzimatico di nuove small molecules che possano fungere da inibitori di Hst3p da utilizzare come agenti antifungini, rappresenta un ulteriore potenziale traguardo di questo progetto.Lavori selezionati nel triennio 2014-2016Sorrentino Claudia, Miele Lucio, Porta Amalia, Pinto Aldo, Morello Silvana (2016). ONCOTARGET, vol. 7, p. 64274-64288, ISSN: 1949-2553, doi: 10.18632/oncotarget.11729 IF=5,168Sorrentino Claudia, Miele Lucio, Porta Amalia, Pinto Aldo, Morello Silvana (2015). ONCOTARGET, vol. 6, p. 27478-27489, ISSN: 1949-2553, doi:10.18632/oncotarget.4393 IF= 5,168De Cicco Felicetta, Reverchon Ernesto, Adami Renata, Auriemma Giulia, Russo Paola, Porta Amalia, Aquino Rita Patrizia, Del Gaudio Pasquale (2014). CARBOHYDRATE POLYMERS, vol. 101, p. 1216-1224, ISSN: 0144-8617, doi: 10.1016/j.carbpol.2013.10.067 IF= 4,811Amalia Porta, Silvana Morello, Ilaria Granata, Raffaella Iannone, Bruno Maresca (2014). THE FEBS JOURNAL, vol. 281, p. 5043-5053, ISSN: 1742-464X, doi: 10.1111/febs.13042 IF= 3,902 X 1,5 = 5,853Di Giacomo, R, Daraio, C, Maresca, B. (2015). PNAS 112(15), pp. 4541-4545 IF= 9,661