Fabrizio DAL PIAZ | Progetti

STUDIO SULL¿INCIDENZA E PREVALENZA DELLE ADR LEGATE ALL¿UTILIZZO DELLE FLUOROPIRIMIDINE IN PAZIENTI ONCOLOGICI PORTATORI DELLE VARIANTI DELLA DIIDROPIRIMIDINA DEIDROGENASI

Questo progetto si propone di realizzare un monitoraggio delle ADR associate all’utilizzo di fluoropirimidine e di eseguire un’analisi di associazione tra tali ADR, il genotipo e il profilo di attività della DPD.Sarà arruolato un totale di 200 pazienti oncologici candidati alla chemioterapia a base di fluoropirimidina, afferenti all’ UOC di Oncologia Medica dell'AOU "San Giovanni di Dio e Ruggi d'Aragona" di Salerno. Tutti i pazienti saranno invitati a firmare un modulo di consenso informato. Per ciascun paziente sarà compilata una scheda (Case Report Form, CRF) contenente le informazioni relative al paziente e alla patologia oncologica. Particolare attenzione sarà rivolta alla registrazione delle ADR con una sezione dedicata alla descrizione della tipologia (es. ematologica, gastrointestinale) e al grado si severità. Le ADR saranno categorizzate sulla base dei criteri RECIST (Response Evaluation Criteria in Solid Tumours) in: lievi (grado 1); clinicamente rilevanti (grado 2); gravi e/o pericolose per la vita (grado 3–4) e fatali (grado 5). Tutti i dati demografici, anamnestici e clinici saranno collezionati in un database dedicato e costantemente aggiornato a ogni ciclo chemioterapico. Per rispettare la privacy dei pazienti saranno utilizzati esclusivamente codici identificativi numerici.Un campione di sangue intero di 6 ml sarà prelevato da ciascun paziente arruolato tra le 8:00 e le 10:00 antimeridiane. Tale campione sarà collezionato in provetta BD vacutainer contenente EDTA come anticoagulante. Dal campione di sangue sarà isolato il DNA genomico che servirà per l’analisi di genotipizzazione e aliquote di plasma destinate all’analisi dell’attività dell’enzima DPD.Analisi di genotipizzazione:I campioni di DNA genomico saranno isolati da ciascun campione di sangue intero mediante un kit commerciale per l’isolamento degli acidi nucleici. Il DNA genomico sarà analizzato qualitativamente tramite corsa elettroforetica e quantitativamente tramite quantizzazione spettrofotometrica alla lunghezza d’onda di 260 nm. La stima del rapporto 260/280 nm servirà a valutare la purezza del campione.I pazienti saranno stratificati sulla base del genotipo rilevante i polimorfismi riconosciuti come fattori influenzanti l’evenienza di tossicità da fluoropirimidina, già descritti nella sezione “BASE DI PARTENZA SCIENTIFICA” della presente proposta progettuale, ossia i loci genici (SNP) DPYD*2A (DPYD IVS14+1G>A, rs3918290) e DYPD 2846A>T (rs67376798).Per lo screening sarà utilizzata la piattaforma Quant Studio 3 (life Science Technology) collocata presso il Laboratorio di Farmacogenetica del Servizio di Farmacologia Clinica dell’ AOU, mediante la metodica Real-Time PCR con allelic discrimination. Tale saggio di discriminazione allelica prevede l’utilizzo di sonde “TaqMan® SNP Genotyping assays” e oligonucleotidi di innesco (primers) specifici per i loci genici da analizzare. La reazione sarà eseguita preparando una miscela di 25 microlitri totali contenente sonde TaqMan® fluorescinate, una premix contenente i primers specifici e circa 20 ng del DNA genomico di ciascun paziente da genotipizzare. I risultati saranno analizzati tramite il software QuantStudioTM Design & Analysis Software v1.4.1 (Applied Biosystems). Analisi dell’attività della diidropirimidina deidrogenasi:Per valutare l’attività della diidropirimidina deidrogenasi (DPD), enzima coinvolto nella conversione dell’uracile in diidrouracile, sarà utilizzata una metodica indiretta basata sulla determinazione del rapporto uracile/diidrouracile. Il rapporto sarà misurato nei campioni di plasma isolati in precedenza da ciascun paziente arruolato mediante cromatografia HPLC (High Performance Liquid Chromatography) su colonna fenilica.Questo studio permetterà di monitorare i pazienti nel corso di tutta la durata del trattamento chemioterapico e di valutare l'impatto dei polimorfismi della DPD sull'attività dell'enzima e quindi sull'evenienza di ADR di grado 3 e 4.