Stefano PEPE | Projects

VARIAZIONI STRUTTURALI E DEREGOLAZIONE DEL LOCUS PD-L1 NEI LINFOMI NON-HODGKIN DIFFUSI A GRANDI CELLULE.

Centocinquanta biopsie e sospensioni cellulari linfonodali relative a NHL e processi reattivi policlonali saranno raccolte in vivo da altrettanti pazienti afferenti alla AOU dell’Università di Salerno. Il materiale utilizzato sarà residuale a quello impiegato per diagnostica routinaria. I pazienti saranno informati dello studio e daranno il loro assenso mediante firma di consenso informato. Lo studio sarà approvato dal Comitato Etico Campania Sud. Da tessuti fissati in formalina ed inclusi in paraffina si prepareranno sezioni di 3 mm di spessore. Le sospensioni cellulari in 1000 µL di PBS saranno, invece ripartite in 600 µL da utilizzare per la valutazione citofluorimetrica ed i restanti 400 L saranno divisi in due aliquote di 240 µL crioconservate a -80°C e di 160 µL sospese in FTA card. Le card saranno quindi asciugate e conservate a temperatura ambiente in buste d’alluminio risigillabili fino all’ uso.Fase 1-1: Da due dischi di 3 mm per ciascuna FTA card sarà eseguita estrazione del DNA, utilizzando QIAamp® DNA Micro Kit. La procedura prevederà il legame selettivo del DNA alla membrana di silice della colonna QIAamp secondo procedura standard. Il DNA ottenuto sarà conservato a -20°C fino all’ uso e quantificato mediante NanoDrop 1000 V3.7.1 Spectrophotometer.Fase 1-2: Sezioni bioptiche, fissate in paraffina e formalina, di 10 micron di spessore saranno utilizzate per estrarre DNA e RNA, usando i Kit della Qiagen “QIAamp DNA FFPE Tissue” e “RNeasy FFPE Kit”, rispettivamente, una volta allontanata la paraffina/formalina dal campione attraverso incubazione a 56°C nella QIAGEN Deparaffinization Solution (Cat. N. 19093). DNA e RNA ottenuti saranno conservati a -20°C e a -80°C, rispettivamente, fino al momento dell’uso e quantificati mediante NanoDrop 1000 V3.7.1 Spectrophotometer.Fase 2: Analisi di gene profiling (GEP) saranno eseguite per i campioni diagnosticati DLBCL all’analisi IHC, con i seguenti anticorpi CD10, BCL6, IRF4/MUM1, per definire il centro di origine (COO) del linfoma. A tal fine 200 ng di RNA saranno utilizzati per eseguire anali di digital GEP usando tecnologia NanoString (Seattle, WA) Lymph2Cx assay, secondo metodologia Affymetrix U133, per determinare l’espressione di 20 geni definenti l’origine ABC o GCB dei DLBCL.Fase 3: L’analisi di BCL2-JH derivante dalla traslocazione t(14;18) sarà eseguita per tutti i campioni DLBCL attraverso amplificazioni PCR del DNA estratto da sezioni in paraffina e/o da FTA card. La traslocazione sarà identificata mediante una strategia di PCR nested utilizzante due coppie di primer separate, per ogni step PCR, identificanti le regioni di major breakpoint region (MBR), minor cluster region (mcr) e JH consensus region. I prodotti PCR saranno valutati per analisi elettroforetica eseguita su gel di agarosio al 2%.Fase 4: Riarrangiamenti del gene PD-L1, ed in particolare di CD274 con altri cromosomi, saranno identificati mediante PCR singole con 17 coppie di primers. Le PCR saranno eseguite su DNA estratto da a sezioni in paraffina e/o da FTA card. I prodotti PCR saranno valutati per analisi elettroforetica eseguita su gel di agarosio al 2%.Fase 5: Un analisi statistica dei dati ottenuti sarà eseguita utilizzando Student-t test per dati appaiati per valutare i risultati di PCR con quelli ottenuti con metodiche routinarie. La consistenza tra gli algoritmi di classificazione Hans e Choi dei DLBCL sarà analizzate tramite Kappa test. Analisi Multivariata sarà eseguita usando il metodo Cox Regression e tutte le analisi statistiche saranno eseguite mediante software SPSS.