Annibale Alessandro PUCA | Progetti

LAV-BPIFB4 IN UN MODELLO CELLULARE NEURALE: UNA STRATEGIA PER SALVAGUARDARE L¿OMEOSTASI CELLULARE?

Lo studio verrà effettuato utilizzando la linea cellulare umana di neuroblastoma SHSY5Y. Si tratta di un modello neuronale comunemente utilizzato proprio per le sue proprietà neuron-like: se trattate con acido retinoico, BDNF o TPA le cellule infatti, sono in grado di sviluppare dendriti e differenziare. Le cellule verranno infettate con particelle lentivirali codificanti per la proteina WT-BPIFB4, la sua isoforma LAV o un costrutto vuoto di controllo. La porzione di costrutto destinato ad integrarsi nella cellula ospite conterrà inoltre un gene codificante per la proteina GFP (Green Fluorescent Protein) ed uno di resistenza all’antibiotico neomicina che ci consentiranno di selezionare le cellule infettate stabilmente. L’effettiva espressione di BPIFB4 verrà verificata tramite real-time PCR e analisi di WesternBlot (WB). BPIFB4 è normalmente espressa nelle cellule staminali ed è in grado di influenzarne il processo di differenziamento. Per questo ci proponiamo di analizzare il tempo di duplicazione, la curva di crescita e la capacità di proliferazione (saggio della BrdU) nelle cellule infettate con le varie isoforme. Le cellule verranno quindi indotte a differenziare in neuroni utilizzando acido retinoico e l’espressione dei marker di differenziamento e staminalità verrà valutata tramite real-time PCR e WB a diversi intervalli di tempo, permettendoci di confrontare l’azione delle varie isoforme di BPIFB4 sull’intero processo. Dati preliminari da noi raccolti ci hanno permesso di dimostrare un’azione di BPIFB4 anche sul metabolismo cellulare in cellule HeLa. Il consumo di ossigeno (Oxygen consumption rates, OCR) come indicatore del processo di OXPHOS e l'acidificazione extracellulare (Extracellular acidification rates, ECAR) come marker di glicolisi aerobica, verranno perciò analizzati utilizzando il Seahorse flux analyzer nelle cellule infettate prima e dopo il differenziamento. Inoltre per verificare la capacità di LAV-BPIFB4 di contrastare lo stress mantenendo l’omeostasi cellulare ossidativo, le cellule differenziate e non verranno sottoposte a vari tipi di shock (ossidativo, termico). La formazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS), verrà misurata incubando le cellule con il DCF-DA e quantificando tramite spettrofotometro il prodotto fluorescente che si forma. La produzione di superossido a livello mitocondriale verrà analizzata utilizzando il composto fluorescente MitoSOX Red e quantificata tramite analisi al FACS. Il numero ed il volume medio dei mitocondri verrà inoltre misurato utilizzando il marcatore specifico Mitotracker ed un sistema di ricostruzione 3D con il microscopio confocale a fluorescenza.