Maria Teresa PELLECCHIA | Progetti

ANALISI DELLE BASI GENETICHE DEL TREMORE ESSENZIALE IN UN'ESTESA FAMIGLIA ITALIANA

Valutazione clinica della famiglia e reclutamento della coorte di controllo di pazienti con TE: Abbiamo identificato un’estesa famiglia italiana con TE a trasmissione autosomica dominante, che comprende 13 individui affetti in tre generazioni. I soggetti affetti saranno rivalutati clinicamente in base ai criteri di Louis (1998) per stabilire una diagnosi “definita”, “probabile” o “possibile”. In alcuni soggetti affetti il TE cosegrega con ipoacusia. Presso gli ambulatori del centro per la malattia di Parkinson e i disordini del movimento dell’AOU San Giovanni di Dio e Ruggi d’Aragona saranno inoltre selezionati 100 pazienti con diagnosi “definita” di TE. Sarà registrata la presenza di eventuali altri sintomi associati al tremore, come l’ipoacusia.Studio genetico:I campioni di DNA di 4 membri affetti con diagnosi “definita” di TE, possibilmente associata a ipoacusia, saranno utilizzati per il sequenziamento dell’intero esoma. Il DNA estratto verrà analizzato per valutarne la qualità e quantità; poi si procederà alla preparazione delle librerie. Durante la preparazione il DNA verrà frammentato per sonicazione in frammenti di circa 200-250Kb e arricchito tramite un kit (“Agilent SureSelect all exome kit”) che permette di catturare solo le regioni codificanti del genoma (circa 50Mb). Una volta preparate le librerie queste verranno ancorate a biglie, amplificate tramite emulsion-PCR e poi arricchite e modificate così da poterle infine sequenziare. Il sequenziamento avverrà utilizzando un sequenziatore di ultima generazione (“Life Technologies SOLiD 5500xL platform”), prevedendo un coverage medio teorico di 100-150X.I risultati del sequenziamento saranno analizzati da esperti bioinformatici (in collaborazione con l’Istituto CSS-Mendel di Roma) che valuteranno inizialmente la qualità dei dati ottenuti, e successivamente analizzeranno i dati per la ricerca di mutazioni a singola base, inserzioni e delezioni nei campioni esaminati e non presenti nei controlli sani non correlati.Le varianti identificate, condivise dai 4 soggetti affetti, verranno controllate per la loro assenza nei database pubblici, quali dbSNP, 1000genomes and Exome Variant Server (EVS), e sarà esaminata la loro patogenicità tramite software di predizione quali Polyphen-2, SIFT, MutPred e altri. Tutte le varianti trovate, non riportate come polimorfismi noti, e predette come potenzialmente patogeniche, saranno poi validate tramite sequenziamento Sanger e, se confermate, sarà valutata la loro segregazione in tutti i membri familiari disponibili. I geni candidati saranno sequenziati nella coorte di 100 pazienti italiani con TE, alla ricerca di altri pazienti portatori di mutazioni nello stesso gene.Aspetti innovativi e ricadute del progetto: Non sono attualmente noti geni responsabili di TE nella popolazione europea ed italiana in particolare. Questo studio permetterà di migliorare la diagnosi e il counseling genetico della malattia e di comprendere meglio la fisiopatologia del TE.Pubblicazioni per valutazione rilievo scientifico dei richiedenti:1) Novelletto A, et al, Barone P, Mandich P. Linkage exclusion in Italian families with hereditary essential tremor. Eur J Neurol 2011;18:e118-202)Barone P, et al. Pramipexole for the treatment of depressive symptoms in patients with Parkinson's disease: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet Neurol 2010;9:573-803)Moreno-López C, et al, Pellecchia MT, et al. Excessive daytime sleepiness in multiple system atrophy. Arch Neurol 2011;68:223-2304)Pappatà S, Pellecchia MT, et al. Mild cognitive impairment in drug-naive patients with PD is associated with cerebral hypometabolism. Neurology 2011;77:1357-13625)Valente EM, et al. Mutations in TMEM216 perturb ciliogenesis and cause Joubert, Meckel and related syndromes. Nat Genet. 2010 Jul;42(7):619-25.6)Lee JH, Valente EM, et al. Evolutionarily assembled cis-regulatory module at a human ciliopathy locus. Science 2012;335:966-9