Viviana IZZO | Progetti

VALUTAZIONE DELL'ATTIVITÀ  BIOLOGICA DI NUOVI CATECOLI ANTIOSSIDANTI, OTTENUTI PER VIA BIOSINTETICA, SU LINEE CELLULARI IN COLTURA

Nonostante la numerosa presenza di composti catecolici in database di settore quali il “Comprehensive Medicinal Chemistry”, solo un esiguo numero di essi è approvato dalla FDA per l’utilizzo terapeutico, a riprova di un problema di tossicità di tali molecole non ancora del tutto chiarito, e che va analizzato in dettaglio per l’ottimizzazione del futuro design di nuovi antiossidanti basati su questo scaffold chimico. E' quindi importante raccogliere maggiori informazioni sulla relazione struttura-funzione dei catecoli e di loro derivati da utilizzare in ambito farmacologico. E’ infatti noto che la diversa natura dei sostituenti legati all’anello catecolico ne influenza la reattività nei confronti degli agenti ossidanti, la farmacocinetica nonché la distribuzione tissutale e cellulare. Modifiche a carico dell'anello aromatico possono essere ottenute anche per via enzimatica come nel caso della glicosilazione, una modifica strutturale importante dei composti bioattivi che può incrementare, fra gli altri, il carattere idrofilico delle molecole. In questo ambito, il presente progetto di ricerca si propone di caratterizzare le attività biologiche di tre nuovi catecoli modello (Fig.2) ottenuti precedentemente dai proponenti per via biosintetica, per i quali è stata già dimostrata in vitro una considerevole attività antiossidante. Questo studio consentirà di raccogliere informazioni utili per ulteriori modifiche chimiche a carico di queste molecole. Il progetto si articola secondo i seguenti obiettivi:1)Valutazione dell’attività antiossidante dei nuovi catecoli su linee cellulari in coltura.I catecoli saranno analizzati sulle linee cellulari selezionate per verificarne l’effetto citotossico (saggio MTT), e l’effetto apoptotico (etidio bromuro/arancio acridina); ciò servirà ad ottenere stime delle concentrazioni ottimali dei catecoli da utilizzare negli studi successivi. Verrà poi valutato l’effetto protettivo dei catecoli su linee cellulari sottoposte a stress ossidativo indotto da arsenito di sodio. A tal fine, in cellule trattate e non saranno valutati i seguenti parametri: a) presenza di “granuli da stress”; b) stato di ossidazione (Total Oxidant Status, TOS) e capacità antiossidante totale (Total Antioxidant Capacity, TAC); c) attività di enzimi antiossidanti quali Superossido Dismutasi (SOD) e Catalasi (Cat); d) livelli di perossidazione lipidica, mediante il saggio dell’Acido Tiobarbiturico (TBARS), per valutare il danno ossidativo alle membrane; e) livelli di 8-idrossi-2-deossiguanosina (8-OHdG), per valutare il danno ossidativo al DNA; f) livelli di carbonilazione proteica, per valutare il danno ossidativo delle proteine.2)Valutazione di attività biologiche addizionali di interesse farmacologico.I nuovi catecoli saranno analizzati per la presenza di attività biologiche addizionali quali l’attività antinfiammatoria e quella immunomodulante. A tale scopo: a) verranno quantizzati mediante saggi ELISA diversi fattori infiammatori e citochine (NF-kB, TNF-alpha, IL-6); b) verrà analizzata in cellule trattate e non l’attività della Sirtuina 1 (SIRT1), una deacetilasi NAD+ dipendente che svolge un ruolo essenziale per l’omeostasi cellulare, regolando sia la risposta allo stress ossidativo che le risposte immunitarie innata e adattativa.3)Funzionalizzazione dei nuovi catecoli e loro preliminare caratterizzazione in vitro.I nuovi catecoli saranno funzionalizzati mediante l’aggiunta di gruppi glicosidici sfruttando un approccio chimico/enzimatico. A tale scopo verranno utilizzate glicosidasi estratte dal mollusco Aplysia fasciata, già descritte in letteratura per la glicosilazione dell’idrossitirosolo, un potente catecolo antiossidante presente nell’olio extra vergine di oliva. I nuovi catecoli funzionalizzati verranno caratterizzati mediante NMR e e spettrometria di massa per validarne la struttura chimica. Essi saranno inoltre saggiati per la loro attività antiossidante in vitro mediante utilizzo del saggio DPPH.