Amelia FILIPPELLI | Projects

GLICOSILAZIONE DI NUOVI FENOLI E CATECOLI ANTIOSSIDANTI OTTENUTI PER VIA BIOSINTETICA E CARATTERIZZAZIONE DELLA LORO ATTIVITA' BIOLOGICA SU LINEE CELLULARI EUCARIOTICHE IN COLTURA.

Lo stress ossidativo rappresenta nella cellula l'effetto finale dello squilibrio fra produzione ed eliminazione di specie chimiche ossidanti, e costituisce l'elemento patogenetico comune di diverse malattie cronico-degenerative. Di conseguenza, una notevole attenzione è stata dedicata nell’ultimo decennio all’identificazione di nuovi antiossidanti naturali o sintetici da utilizzare nell’industria farmaceutica. In questo contesto, tra i farmacofori più diffusi e versatili vi sono sicuramente fenoli e catecoli (Fig. 3), molecole che reagiscono velocemente con diversi agenti ossidanti, fungendo da donatori di elettroni, e che possono essere agevolmente funzionalizzate mediante l’aggiunta di diversi gruppi reattivi quali gruppi glicosidici, selenolici, tiolici etc. Tali modifiche sono di fondamentale importanza in quanto concorrono a influenzare la farmacocinetica, nonché le distribuzioni tissutale e cellulare, di tali molecole. La glicosilazione in particolare può, tra le altre cose, influenzare l’idrofilicità di questi composti provocando cambiamenti sostanziali nella loro attività biologica.In questo ambito, il presente progetto di ricerca si propone di caratterizzare le attività biologiche dei derivati glicosilati di quattro nuovi fenoli e di un catecolo (Fig.2) ottenuti precedentemente dai proponenti per via biosintetica, e per i quali è stata recentemente dimostrata una significativa attività antiossidante (Donadio G. et al, manoscritto in preparazione). Il progetto si articola secondo i seguenti obiettivi: 1)Glicosilazione dei fenoli e dei catecoli ottenuti dall’ossidrilazione di 2-fenossietanolo, ftalano e 2-indanolo.I composti ossidrilati ottenuti durante gli anni precedenti saranno funzionalizzati mediante l'aggiunta di gruppi glicosidici sfruttando un approccio chimico/enzimatico. A tale scopo verranno utilizzate glicosidasi estratte dal mollusco Aplysia fasciata, già descritte in letteratura per la glicosilazione dell'idrossitirosolo, un potente catecolo antiossidante presente nell'olio extra vergine di oliva. I nuovi composti funzionalizzati verranno caratterizzati mediante NMR e spettrometria di massa per validarne la struttura chimica. 2)Valutazione dell’attività antiossidante dei derivati glicosilati in vitro, e su linee cellulari murine (H9c2) ed umane (endoteliali, EA.hy-926, ed epatiche, HepG2). I nuovi composti glicosilati saranno analizzati per la loro attività antiossidante in vitro mediante utilizzo del saggio DPPH, con conseguente valutazione dell’efficienza antiradicalica (AE). Successivamente, i nuovi composti saranno utilizzati sulle linee cellulari selezionate per verificarne la citotossicità (saggio MTT), e l'effetto apoptotico (etidio bromuro/arancio acridina); ciò servirà ad ottenere stime delle concentrazioni ottimali dei composti da utilizzare negli esperimenti successivi. Verrà poi valutato l'effetto protettivo dei composti glicosilati sulle cellule sottoposte a stress ossidativo indotto da agenti quali il perossido di idrogeno e l’arsenito di sodio. A tal fine, in cellule trattate e non saranno valutati i seguenti parametri: a) effetti sulla senescenza cellulare (β-gal staining); b) presenza di “granuli da stress” (immunofluorescenza); c) stato di ossidazione (Total Oxidant Status, TOS) e capacità antiossidante totale (Total Antioxidant Capacity, TAC); d) attività di enzimi antiossidanti (Superossido Dismutasi e Catalasi).3)Valutazione di attività biologiche addizionali, quali quella immunomodulante ed antinfiammatoria, dei nuovi derivati glicosilati ottenuti. Nell’ambito di tale obiettivo: a) verranno quantizzati mediante saggi ELISA diversi fattori infiammatori e citochine (NF-kB, TNF-alpha, IL-6); b) verrà analizzata in cellule trattate e non l'attività della Sirtuina 1 (SIRT1), una deacetilasi NAD+ dipendente che svolge un ruolo essenziale per l'omeostasi cellulare, regolando sia la risposta allo stress ossidativo che le risposte immunitarie innata e adattativa.