Gennaro GALASSO | Progetti

RUOLO DELLA PROTEINA BAG3 IN MODELLI DI PLASTICITA' NEURALE

La ricerca prevista dal presente progetto, si propone di indagare il ruolo svolto dalla proteina BAG3 nella plasticità sinaptica ed l'eventuale coinvolgimento della proteina nelle malattie del neurosviluppo e neurodegenerative. In particolare si prevede di:1 Studiare l’espressione di BAG3 e di altre proteine regolate da BAG3 in colture primarie da tessuto nervosoLa migrazione neuronale, la morfogenesi e la sinaptogenesi sono sotto il controllo degli elementi stabili e dinamici del citoscheletro. La piccola GTPasi Rac1 regola il citoscheletro di actina durante la formazione, la maturazione e il mantenimento delle spine dendritiche. Recentemente è stato ipotizzato un ruolo di controllo della proteina BAG3 su Rac1 suggerendo che BAG3 possa essere un modulatore della motilità cellulare, sia mediante la regolazione dei livelli di polimerizzazione dell’actina, sia attraverso un effetto diretto o indiretto su Rac1. Considerate tali osservazioni ci si propone una caratterizzazione immunocitochimica dell’espressione di BAG3 e di Rac1 in modelli in vitro di colture primarie di neuroni, astrociti e microglia di ratto e topo. Inoltre, poiché è noto che la GTPasi Rac 1 regola ed attiva il fattore trascrizionale STAT3, coinvolto anch’esso direttamente nel controllo dei processi di riorganizzazione del citoscheletro di actina, colture di cellule nervose verranno trattate con inibitori di STAT3 e Rac1. Tali esperimenti saranno condotti per osservare eventuali modificazioni della localizzazione della proteina BAG3. Si procederà quindi, a silenziare l’attività di BAG3 al fine di osservare l’effetto dell’inibizione di BAG3 sull’espressione delle altre proteine studiate. Nel valutare l’espressione della regolazione delle proteine del citoscheletro in cellule nervose, si prevede di focalizzare l’indagine anche sulla chinasi glicogeno sintasi GSK3beta e sui suoi inibitori, come il litio, perchè riducono l’attività di STAT3 riducendo i suoi livelli di fosforilazione in colture primarie attivate dall’interferone gamma ed alfa, dall’interleukina-6, o dall’insulina.Lo studio della colocalizzazione della proteina BAG3 e dei suoi possibili partners sarà effettuata su colture cellulari sincronizzate in condizioni basali e di stress. Ai dati morfologici ottenuti in microscopia confocale, time lapse e al TEM faranno seguito indagini di natura biochimica: Western Blotting, coimmunoprecipitazione, RT-PCR.2 Analizzare il ruolo funzionale di BAG3 nella sinaptogenesiAllo scopo di fornire informazioni significative sul ruolo di BAG3 nella sinaptogenesi, si procederà all’allestimento di culture di cellule di feocromocitoma murino PC12, indotte al differenziamento in neuroni catecolaminergici mediante trattamento con NGF. In questo noto modello di differenziamento, verrà studiata la localizzazione cellulare della proteina BAG3 a differenti fasi dello sprouting assonale mediante immunocitochimica. Si procederà anche a verificare l’eventuale colocalizzazione con gli altri potenziali partners coinvolti nella riorganizzazione del citoscheletro. Particolare attenzione sarà rivolta allo studio dello sprouting assonale mediante time lapse. Alle indagini di natura immunocitochimica in microscopia confocale e al TEM seguiranno indagini di natura biochimica: Western Blotting, coimmunoprecipitazione. Di particolare interesse sarà la messa a punto di una tecnica di cocoltura di astrociti e neuroni, astrociti e Huvec, neuroni e Huvec allo scopo di indagare come i vari tipi di cellule possano influenzarsi a vicenda. Si prevede di valutare anche in questo modello l’eventuale modulazione nell’espressione della proteina BAG3 e dei suoi partners. Saranno condotti studi di immunocitochimica in microscopia confocale e al TEM ed indagini di natura biochimica: Western Blotting,immunoprecipitazione. Saranno eseguite mediante ELISA studi sul sovranatante di coltura al fine di determinare l’eventuale presenza di una forma solubile di BAG3