Giovanna DELLA PORTA | TESI Magistrale Febbraio 2023
Giovanna DELLA PORTA TESI Magistrale Febbraio 2023
Marianna ROCA
STUDIO DI UN MODELLO 3D BIOMIMETICO PER IL COMMITMENT TENOGENICO DI CELLULE STAMINALI UMANE ESTRATTE DA BIOPSIE TENDINEE
Abstract: I processi della rigenerazione tissutale si basano sulla presenza di popolazioni di cellule di riserva localizzate nei diversi tessuti. Tali cellule sono tanto più abbondanti quanto maggiore è la capacità e la necessità rigenerativa di quel tessuto. Si tratta delle cellule staminali, cellule immature in grado di moltiplicarsi all’infinito generando cellule identiche a se stesse che possiedono la capacità di specializzarsi nelle diverse tipologie cellulari mature dei tessuti e degli organi in cui si trovano. L’ingegneria tissutale è una scienza multidisciplinare che studia i processi rigenerativi attraverso l’allestimento di colture biomimetiche tridimensionali 3D. Essa rappresenta oggi una delle tematiche più importanti di ricerca in ambito medico-ingegneristico per lo studio dei meccanismi della riparazione tissutale attraverso lo sviluppo di modelli in vitro che consentono di osservare e comprendere i processi fisiologici di rigenerazione. Tali modelli di studio sono costituiti da costrutti bioingegnerizzati e tridimensionali coltivati in ambienti biomimetici.
L’obiettivo del presente lavoro di tesi è valutare e sviluppare un modello di coltura biomimetico per promuovere il differenziamento tenogenico in vitro di cellule staminali umane estratte da espianti tendinei umani (human Tendon Stem Progenitor Cells, hTSPCs). Lo scopo è stato raggiunto valutando l’impiego di due sistemi di coltura: (i) bidimensionale (2D) su piastra; (ii) tridimensionale mediante l’ausilio di uno “scaffold” di fibrina. Entrambe le colture sono state condotte in condizioni dinamiche mediante un bioreattore a perfusione. Il differenziamento è stato promosso con l’aggiunta al medium di coltura del fattore di crescita trasformante beta 1 (TGF-β1) alla concentrazione di 20 ng/mL. Nel caso della coltura 3D come biomateriale è stata selezionata la fibrina per la realizzazione dello “scaffold” tridimensionale ed è stata ottimizzata la concentrazione di fibrinogeno ottimale
Il differenziamento tenogenico delle hTSPCs è stato valutato attraverso l’analisi dell’espressione genica dei markers correlati al fenotipo tenogenico, quali scleraxis (SCX-A), decorina (DCN), tenascina (TCN), collagene di tipo I (COL1A1) e collagene di tipo III (COL3A1). La presenza del collagene è stata indagata anche mediante tecniche di immunofluorescenza e immunoistochimica. Inoltre, è stata studiata l’espressione genica delle citochine pro-infiammatorie quali interleuchina 6 (IL-6), fattore di necrosi tumorale (TNF), interleuchina 12A (IL-12A), interleuchina 1β (IL-1β) e delle citochine anti-infiammatorie, interleuchina 10 (IL-10) e il fattore di crescita trasformante β1(TGF-β1). La coltura 3D, in un hydrogel di fibrina in condizioni dinamiche a perfusione, è risultata particolarmente favorevole e biomimetica per le hTSPCs, le quali hanno espresso i geni costitutivi e hanno mostrato una ridotta espressione delle citochine infiammatorie. Inoltre, la coltura 3D è risultata più biomimetica rispetto allo stesso modello in vitro ottenuto in 2D su piastra a perfusione, dal momento che l’espressione dei geni tenogenici risulta sovraespressa di 6 volte a 21 giorni per SCX-A (p < 0.05) e TCN (p < 0.05), e di 4 volte a 21 giorni per COL1A1 (p < 0.05). Inoltre, le cellule dopo 21 giorni di coltura hanno espresso solo i geni per IL-6 e il TGF-β1, per quest’ultimo è stata osservata un’upregulation di 9 volte a 21 giorni (p < 0.0001).
In conclusione, è stato sviluppato un buon modello di coltura in vitro per lo studio dei processi alla base del differenziamento tendineo.
Tale risultato apre prospettive per l’impiego del modello 3D ottimizzato per lo sviluppo di un modello in vitro di patologia tendinea utilizzando le TSPCs estratte da espianti chirurgici di pazienti tendinopatici.
