Giovanna DELLA PORTA | TESI Magistrale Febbraio 2023

Estrazione di cellule staminali umane da espianti tendinei al fine di allestire un modello di tendinopatia 3D in vitro

Abstract: Le patologie tendinee rivestono grande interesse per l’elevata incidenza con cui si verificano, per la difficoltà di ottenere una guarigione completa con un pieno recupero funzionale delle strutture coinvolte e perché comportano lunghi periodi di inattività. Le terapie mediche e chirurgiche normalmente impiegate agiscono con l’intento di bloccare il processo infiammatorio, prevenire ulteriori danni al tessuto tendineo e ai tessuti circostanti, diminuire le tensioni e aumentare la vascolarizzazione a livello della lesione.
L’Ingegneria Tissutale, combinando l’uso di biomateriali, cellule e fattori di crescita, promuove lo sviluppo di modelli in vitro per lo studio di interazioni complesse cellula-cellula in condizioni sia fisiologiche che patologiche. Le cellule staminali progenitrici tendinee (TSPCs), sono state recentemente identificate come una fonte cellulare promettente per la rigenerazione del tessuto tendineo. Queste cellule possiedono le caratteristiche delle Cellule Staminali Mesenchimali (MSCs) come l'autorinnovamento, la clonogenicità e la multidifferenziazione; inoltre, supportano la rigenerazione nel sito di lesione del tendine.

Lo scopo di questo lavoro di tesi è di allestire una coltura tridimensionale in dinamico, bioingegnerizzata con Cellule Staminali Progenitrici Tendinee (TSPCs), provenienti da pazienti affetti da tendinopatia, ed utilizzarlo come modello di studio dei meccanismi di rigenerazione tendinea in condizioni patologiche. Il differenziamento tenogenico delle TSPCs è stato favorito mediante l’aggiunta al mezzo di coltura del fattore di crescita trasformante beta 1 (o TGFβ1). Il TGFβ1 induce la proliferazione cellulare, stimola la produzione di Collagene e del fattore di trascrizione Scleraxis (SCX). La fibrina è stata utilizzata come biomateriale per la realizzazione di un idrogelo bioingegnerizzato. La coltura tridimensionale è stata mantenuta in condizioni dinamiche tramite l’utilizzo di un bioreattore a perfusione per facilitare gli scambi di ossigeno e nutrienti, riproducendo l’ambiente fisiologico cellulare e assicurando un costante ed adeguato ricambio del mezzo di coltura cellulare. La caratterizzazione delle TSPCs è avvenuta attraverso tecniche di Microscopia Ottica (MO), Citometria a Flusso (FACS) e Reazione Quantitativa a catena della Polimerasi in tempo reale (qRT-PCR). Per esplorare il differenziamento tenogenico delle TSPCs, è stata effettuata l’analisi dell’espressione genica dei markers correlati al fenotipo tenogenico, quali Collagene I (COL1A1), Collagene III (COL3A1), Scleraxis-A (SCX-A), Decorina (DCN) e Tenascina (TCN). È stata analizzata successivamente l’espressione genica di citochine pro-infiammatorie (IL-6, TNF, IL-12A, IL-1β) e anti-infiammatorie (IL-10, TGF-β1) per comprendere l’effetto del mezzo supplementato con TGF-β1 sulla loro espressione. L’espressione proteica del Collagene è stata indagata anche mediante tecniche di immunofluorescenza e immunoistochimica.

L’estrazione delle TSPCs da espianti tendinei (sani/patologici) ha evidenziato le differenze morfologiche e di espressione genica, confermando la regolazione dell’infiammazione da parte delle stesse TSPCs, nel tendine affetto da patologia.
La realizzazione dello scaffold 3D di Fibrina, bioingegnerizzato con TSPCs e coltivato in condizioni dinamiche, con l’aggiunta al mezzo di coltura di TGF-β1, risulta confermare l’effetto anti-infiammatorio del TGF-β1. Infatti, le cellule in coltura hanno confermato l’espressione dei geni tenogenici e ridotto l’espressione di Collagene III e citochine pro-infiammatorie.

Questo lavoro di tesi apre interessanti prospettive future che concernono l’utilizzo di un valido modello in vitro per lo studio dei pathway biochimici alla base delle patologie tendinee ed eventualmente, lo sviluppo di formulazione farmaceutiche.